常壓高濃度氧對(duì)新生鼠血小板CD62P表達(dá)及腦和肺SOD、MDA的影響.pdf

1、背景及目的：氧療是新生兒缺氧性疾病必不可少的治療手段之一。但長(zhǎng)時(shí)間吸入高濃度氧對(duì)機(jī)體、器官有嚴(yán)重的毒性作用。臨床應(yīng)用的高濃度氧主要有常壓高濃度氧(normobarichyperoxia，NH)和高壓氧(hyperbaricoxygen，HBO)兩種，前者應(yīng)用更廣泛。高壓氧在理想的劑量下發(fā)生中毒的機(jī)率較小，而常壓高濃度氧療所致的潛在或顯性氧中毒經(jīng)常發(fā)生[1]。近年來(lái)研究認(rèn)為氧自由基在氧中毒損害中起重要作用。自由基是最外層軌道上有不配對(duì)電子

2、的原子或原子團(tuán)，性質(zhì)極不穩(wěn)定，正常存在體內(nèi)有殺滅細(xì)菌和寄生蟲(chóng)等作用，但當(dāng)其產(chǎn)生過(guò)多時(shí)，使脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白交聯(lián)、損傷核酸等引起機(jī)體損傷[2]。另外，一些實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果均表明氧中毒時(shí)血細(xì)胞、血流速度和血管壁有一定的病理改變，可能是氧中毒的致病因素之一。CD62P屬于黏附分子選擇素家族的主要成員[3，4]，正常時(shí)存在于靜息血小板的α顆粒膜上，血小板活化時(shí)，隨活化血小板的“脫顆粒”作用而移位與血小板質(zhì)膜結(jié)合，成為活化血小板的重要標(biāo)記物，并介導(dǎo)血小

3、板與粒細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，最終導(dǎo)致組織損傷[5，6]。CD62P是反映血小板活化較好的指標(biāo)[7]。氧中毒的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，血小板的活化是否為氧中毒的發(fā)病因素之一，目前尚未見(jiàn)到關(guān)于此方面的報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立常壓高濃度氧氧中毒的新生鼠模型，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其全血中血小板膜糖蛋白CD62P的表達(dá)，并檢測(cè)其腦組織和肺組織的SOD和MDA的含量，探討氧自由基及血小板活化在高氧損傷中的作用機(jī)制，為臨床合理用氧及防治氧中毒提供實(shí)

4、驗(yàn)依據(jù)。 方法：1.正常健康出生12小時(shí)內(nèi)的昆明小鼠分成高氧組和對(duì)照組，每組5窩，每窩8只。高氧組置于密閉氧箱中，持續(xù)輸入氧氣，氧濃度大于或等于90％，鈉石灰吸收二氧化碳。溫度，濕度恒定。每天定時(shí)開(kāi)箱1小時(shí)，添加水、飼料及更換墊料。對(duì)照組的小鼠置于同一空氣中，飼養(yǎng)方法與高氧組相同。 2.分別于通氣1天，3天，7天，14天，21天，小鼠斷頭取全血0.5ml，用EDTA-Na1：9抗凝，流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板膜糖蛋白CD62P

5、的表達(dá)。 3.斷頭處死后的新生鼠，完整剝離腦組織和肺組織后，取右側(cè)腦組織及右肺組織制作腦勻漿和肺勻漿，于-30℃冰箱保存待測(cè)。最后腦和肺組織勻漿用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD，硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA。 4.左肺和左腦置于10％福爾馬林液中保存固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片及HE染色光鏡下觀察組織學(xué)的改變。 結(jié)果：1.高氧對(duì)新生鼠一般狀況的影響 新生鼠高氧暴露5天后，有的新生鼠隨著每日開(kāi)箱后氧濃度的下降開(kāi)始逐漸

6、出現(xiàn)呼吸急促，皮膚蒼白和不同程度的發(fā)紺等表現(xiàn)，這些改變出現(xiàn)的時(shí)間和表現(xiàn)程度因個(gè)體而不一，但在恢復(fù)高氧后基本可緩解。隨著高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，越來(lái)越多的新生鼠出現(xiàn)這些離高氧后的異常表現(xiàn)并且程度逐漸加重，嚴(yán)重者在7～10天后出現(xiàn)頭顫，發(fā)紺加重，甚至出現(xiàn)下頜式呼吸，恢復(fù)供氧后，上述癥狀雖可有所緩解，但仍表現(xiàn)出活動(dòng)少，反應(yīng)差，精神萎靡，毛發(fā)欠光澤，吸吮能力差等。而對(duì)照組新生鼠則活動(dòng)好，反應(yīng)靈敏，膚色紅潤(rùn)，毛發(fā)光澤，無(wú)以上異常表現(xiàn)。 2.肺

7、的病理改變 高氧組新生鼠在高氧吸入后1天時(shí)肺組織與空氣組無(wú)明顯差別；3天時(shí)可見(jiàn)小血管擴(kuò)張、充血和肺泡內(nèi)少量出血，以中性粒細(xì)胞為主的滲出、間質(zhì)內(nèi)細(xì)胞增多；7天時(shí)仍可見(jiàn)肺泡內(nèi)出血、間質(zhì)水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)細(xì)胞明顯增加，有的表現(xiàn)為肺間隔變薄，有的肺組織正常結(jié)構(gòu)局灶性破壞致肺結(jié)構(gòu)紊亂，同時(shí)發(fā)現(xiàn)終末氣腔明顯擴(kuò)張、小肺泡數(shù)量減少，提示肺的正常分化發(fā)育受阻；14天和21天間隔更薄，小灶或多灶狀實(shí)變，肺組織正常結(jié)構(gòu)破壞，終末氣腔擴(kuò)張更為明顯

8、、小肺泡數(shù)量更少。 3.腦的病理改變 高氧組各時(shí)間點(diǎn)處死的大鼠腦外觀與對(duì)照組相比無(wú)明顯充血、水腫、出血、萎縮等異常變化。光鏡下：1天高氧組和對(duì)照組無(wú)明顯差別。3天高氧組與對(duì)照組相比，高氧組腦毛細(xì)血管出現(xiàn)明顯的擴(kuò)張充血，有大量紅細(xì)胞浸潤(rùn)，腦血管周?chē)g隙增寬，有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。光鏡下腦組織較疏松，呈海綿狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核旁空間變寬，過(guò)量液體堆積于胞內(nèi)或細(xì)胞間，可見(jiàn)腦細(xì)胞間隙增寬。并且隨吸氧時(shí)間延長(zhǎng)，病理切片示腦損傷加重。7天高氧

9、組發(fā)現(xiàn)腦細(xì)胞壞死，并出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)。14天和21天高氧組病理?yè)p傷加重，細(xì)胞壞死明顯。 4.肺組織中MDA含量及抗氧化酶SOD活性的動(dòng)態(tài)變化 吸氧1天，高氧組MDA水平(29.83±6.19nmol/mg)雖高于對(duì)照組(25.63±5.54nmol/mg)，但差異無(wú)顯著性(P＞0.05)；吸氧3天，高氧組MDA水平(54.93±5.53nmol/mg)明顯高于對(duì)照組(22.38±4.36nmol/mg)，有顯著性差異(

10、P＜0.05)；吸氧7天，高氧組MDA水平達(dá)高峰(93.86±13.94nmol/mg)，并持續(xù)至14天(85.36±10.54nmol/mg)；至吸氧21天(48.65±7.19nmol/mg)雖明顯下降，但其含量仍高于對(duì)照組(26.13±4.12nmol/mg)，差異有顯著性(P＜0.05)。隨吸氧時(shí)間的延長(zhǎng)，高氧組與對(duì)照組SOD的活性均逐漸增高，但兩組比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。 5.腦組織中MDA含量及抗氧化酶SO

11、D活性的動(dòng)態(tài)變化 吸氧1天和吸氧3天，高氧組MDA水平(高氧組1天為11.74±1.28nmol/mg；3天為12.98±1.93nmol/mg)雖然高于對(duì)照組(對(duì)照組1天為10.61±2.11nmol/mg,3天為12.22±1.06nmol/mg)，但差異無(wú)顯著性(P＞0.05)；吸氧7天，高氧組MDA水平(15.95±2.03nmol/mg)繼續(xù)升高，與對(duì)照組(11.39±1.07nmol/mg)相比，有顯著性差異(P＜0

12、.05)；吸氧14天(19.46±0.61nmol/mg)、吸氧21天(23.95±1.02nmol/mg)高氧組MDA水平呈進(jìn)行性升高，含量明顯高于對(duì)照組(10.96±0.98nmol/mg，11.45±1.12nmol/mg)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。吸氧1天(538.65±13.77U/mg)和3天(542.28±30.53U/mg)高氧組SOD活力明顯高于對(duì)照組(376.70±10.87U/mg，490.47±22.4

13、8U/mg)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；吸氧7天高氧組(358.62±12.31U/mg)SOD活力明顯低于對(duì)照組(559.81±14.25U/mg)，有顯著性差異(P＜0.05)；至吸氧14天(173.25±29.48U/mg)和21天(119.23±10.61U/mg)SOD活力下降更明顯，與對(duì)照14天(630.78±19.65U/mg)和21天(858.78±15.73U/mg)相比有顯著性差異(P＜0.05)。對(duì)照組SO

14、D活力隨著小鼠的長(zhǎng)大在逐漸增高。 6.血小板膜糖蛋白CD62P的變化 吸氧1天開(kāi)始高氧組新生鼠血小板膜糖蛋白CD62P的表達(dá)[(3.63±1.31)％]高于對(duì)照組[(2.24±1.61)％]，且有顯著性差異(P＜0.05)，此后呈進(jìn)行性增高，均與對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論：1.高氧可造成新生鼠腦和肺的病理?yè)p傷，隨著吸氧時(shí)間的延長(zhǎng)，其病理?yè)p傷逐漸加重。 2.高氧組新生鼠肺組織中的MDA水平明

15、顯升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而SOD活力雖隨吸氧時(shí)間延長(zhǎng)而增高，但與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示氧自由基與高氧肺損傷密切相關(guān)，氧自由基損傷伴隨高氧肺損傷發(fā)生的全過(guò)程。 3.高氧組新生鼠腦組織中的MDA水平隨著吸氧時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SOD活力隨吸氧時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，而對(duì)照組SOD活力隨著小鼠的長(zhǎng)大而逐漸增高，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示氧自由基參與了腦損傷過(guò)程，高氧造成腦組織氧化/抗