麻瘋樹pepc1基因的克隆及其調(diào)控?zé)煵莸鞍踪|(zhì)和油脂合成的作用分析.pdf

1、麻瘋樹主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國栽培或半野生于熱帶地區(qū)和干熱河谷地區(qū)。麻瘋樹種子種仁中含有豐富的油脂成分，因此它很有可能成為未來替代化石能源的具有巨大開發(fā)潛力的木本油料樹種之一。但適宜麻瘋樹種植的土地面積十分有限，麻瘋樹種仁含油量的提高可提高麻瘋樹單位面積產(chǎn)油量，可以緩解在有限適宜土地上發(fā)展麻瘋樹生物柴油的矛盾。通過基因工程技術(shù)導(dǎo)入調(diào)控油脂合成的基因是提高麻瘋樹種子含油率，培育高油新品種的有效方法之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)磷酸烯醇式丙

2、酮酸羧化酶（PEPCase）參與了植物種子油脂合成的調(diào)控，因此通過反義抑制技術(shù)控制麻瘋樹pepc基因的表達(dá)，可能是提高麻瘋樹種子含油量的有效途徑。
　　本研究以麻瘋樹未成熟種子為材料，采用RT-PCR和RACE法從中克隆了麻瘋樹pepc基因的一個(gè)家族成員pepc1，采用生物信息學(xué)分析了其氨基酸序列，構(gòu)建pepc1基因的正義和反義表達(dá)載體，將它們導(dǎo)入煙草，通過轉(zhuǎn)基因煙草的實(shí)時(shí)熒光定量PCR、PEPC酶活性測定、蛋白質(zhì)、脂肪酸含量變化

3、，研究pepc1基因在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平對煙草脂肪酸合成的影響，通過pepc1基因在麻瘋樹不同組織、種子發(fā)育不同階段的表達(dá)模式研究pepc1基因在麻瘋樹中的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況，鑒定麻瘋樹pepc1基因?qū)τ椭铣傻恼{(diào)控作用，為定向遺傳改良提高麻瘋樹種子油含量建立技術(shù)體系和提供科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：（1）通過RT-PCR法克隆了麻瘋樹pepc基因的cDNA片段，在此基礎(chǔ)上又通過5'RACE法克隆了pepc基因的5'端，該cDNA全長31

4、24bp，其中開放閱讀框（ORF）長為2898bp，編碼了965個(gè)氨基酸。
　?。?）通過對麻瘋樹PEPCase蛋白的生物信息學(xué)分析表明，該蛋白的分子量為110.6kD，該蛋白酸性氨基酸占總氨基酸的14.6％，堿性氨基酸占總氨基酸的13.5%，理論等電點(diǎn)6.18，穩(wěn)定系數(shù)為46.5，單條肽鏈屬于不穩(wěn)定蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)卷曲為主，間或α螺旋和β直鏈。麻瘋樹PEPCase蛋白是親水性的，無跨膜區(qū)及信號(hào)肽。本研究克隆的pepc基因

5、編碼的蛋白屬于基因家族中的PEPC1，基因?yàn)閜epc1。與蓖麻的氨基酸同源性最高，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中也與蓖麻先聚合，它與煙草的同源性也很高。通過NCBI的保守功能域（CDD）搜索，發(fā)現(xiàn)在11～965aa之間是一個(gè)典型的大Ppc結(jié)構(gòu)域，搜索蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)46個(gè)功能位點(diǎn)，分為7種模式。麻瘋樹PEPC1的結(jié)構(gòu)特征與大部分PEPC的結(jié)構(gòu)類似，功能位點(diǎn)略有差異。
　?。?）利用克隆獲得的麻瘋樹管家基因actin作為參照。對麻瘋樹pepc

6、1基因進(jìn)行了時(shí)空表達(dá)模式研究，發(fā)現(xiàn)在開花到果實(shí)成熟過程中，在前4個(gè)階段pepc1基因的表達(dá)量是增加的，在后5個(gè)階段表達(dá)量明顯下降，在葉中表達(dá)量不太高。
　　（4）根據(jù)植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S、pBI121的多克隆位點(diǎn)特征和麻瘋樹pepc1基因序列特征，分別構(gòu)建了pepc1基因的正義表達(dá)載體pCAMBIA-KSpepc和反義表達(dá)載體pBI-BXpepc。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將正義、反義pepc1基因轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)卡那霉素

7、篩選、PCR和PCR-Southern鑒定，結(jié)果獲得了3株轉(zhuǎn)正義pepc1基因的煙草和10株轉(zhuǎn)反義pepc1基因的煙草。在對轉(zhuǎn)麻瘋樹pepc1基因煙草的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)正義pepc1基因的煙草，煙草內(nèi)源pepc基因表達(dá)量變化不大，外源pepc1增加。10株轉(zhuǎn)反義pepc1基因的煙草，有7株煙草內(nèi)源pepc基因和外源pepc1基因都降低。
　?。?）通過對轉(zhuǎn)基因煙草葉片PEPCase酶活性、蛋白質(zhì)含量、總脂及脂肪酸含

8、量等指標(biāo)的測定，結(jié)果表明轉(zhuǎn)正義pepc1基因的3株P(guān)EPCase酶活性、蛋白質(zhì)含量均比野生型對照高，這3株植株中有1株總脂含量較對照高，其余兩株較對照低。轉(zhuǎn)反義pepc1基因的10株植株有9株酶活性比對照低，這9株中有5株其蛋白質(zhì)含量比對照低，其中4株的總脂含量比對照高。轉(zhuǎn)基因煙草的脂肪酸組份發(fā)生了一定的變化，但各成分含量主次變化不大。通過對蛋白質(zhì)/總脂比率與野生型對照相比較，最終獲得2株轉(zhuǎn)正義pepc1基因和4株轉(zhuǎn)反義pepc1基因的