成年大鼠嗅球嗅鞘細胞的純化及溶血磷脂酸對其形態(tài)、增殖和表達腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響.pdf

1、第一部分成年大鼠嗅球嗅鞘細胞的純化研究 目的：為嗅鞘細胞(olfactory ensheathing cells，OECs)移植研究的標準化提供一個高效、便于統(tǒng)一的純化方法。 方法：根據(jù)不同細胞貼壁速度的差異和OECs對p75抗體的特異性親合力開發(fā)了一種改良的純化方法。從成年大鼠嗅球中分離出OEcs的原代培養(yǎng)物，在體外培養(yǎng)至第8天，將其分為4組：改良方法純化組、Ramon-Cueto p75抗體免疫吸附純化組、Nash差

2、速貼壁純化組、無純化對照組。在各組處理結(jié)束后的第2、5、8、10、12、14天，用免疫酶細胞化學(xué)染色法進行組間OECs純度比較，從而評估這種改良方法的純化效率。第14天分別用MTT法比較4組細胞活力。 結(jié)果：改良方法組每個時間點的OEcs純度都高于其它3組的對應(yīng)點純度(P<0.05)；各組OEcs純度都隨培養(yǎng)時間延長而降低，但改良方法組的純度變化最小(5.7±1.2％)；第14天，改良方法組的純度仍然高達92.1±1.2％，而其

3、它組最高只有85.2±2.2％。第14天，改良方法組OECs細胞活力與其他三組細胞活力無顯著性差異。 結(jié)論：本研究開發(fā)的OECs改良純化方法純化效率優(yōu)于其相關(guān)方法，而且對OECs的活力無額外損害，可以為移植研究提供高純度、活性良好的OECs。 第二部分LPA對成年大鼠嗅球嗅鞘細胞形態(tài)、增殖及表達BDNF的影響 目的：觀察溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)對體外培養(yǎng)的OECs的形態(tài)、增

4、殖和表達腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotropic factor，BDNF)的影響。 方法：自成年大鼠嗅球獲取原代OECs經(jīng)純化后進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中分別加入1、5、10、20、50μM/L的LPA，為5個實驗組，未加LPA的為對照組。用免疫熒光染色技術(shù)進行OECs鑒定并觀察各組OECs在不同培養(yǎng)條件下的形態(tài)變化。用MTT比色法分別在LPA干預(yù)后12、24、36、48、60、72、84、96小時測定各

5、組OECs增殖情況。用Western Blot技術(shù)在LPA干預(yù)后60小時檢測各組OECs表達BNDF情況。 結(jié)果：LPA干預(yù)后，OECs的主要形態(tài)由突起形向扁平形轉(zhuǎn)變，對照組扁平細胞占22.3±4.0％，實驗組為75.3±4.6％-78.3±5.6％(P<0.0001)。從培養(yǎng)基中去除LPA后這種形態(tài)轉(zhuǎn)變可被逆轉(zhuǎn)。LPA最快于干預(yù)后24小時發(fā)揮顯著的促增殖作用(10μM/L組，P<0.01)，各實驗組OD值均在干預(yù)后60小時達到