非小細(xì)胞肺癌TRF1的表達(dá)及核定位信號序列檢測.pdf

1、研究背景與目的 肺癌的發(fā)病率已成為惡性腫瘤之首,有關(guān)發(fā)生機理一直是研究的方向與熱點.眾多的研究表明,端粒是細(xì)胞衰老、死亡和癌變的重要標(biāo)志,許多端粒蛋白參與了端粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的調(diào)控,當(dāng)端粒蛋白不能保護(hù)端粒末端時,端粒酶得以將端粒重復(fù)序列TTAGGG加到端粒末端,造成細(xì)胞不朝衰老、死亡方向運動,而引起腫瘤.端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(Telomeric Repeat Binding Factor 1,TRF1)就是端粒結(jié)合蛋白的一種,TRF

2、1由439個氨基酸組成,分子量約60KD,研究結(jié)果表明TRF1是端粒延長的一個抑制因子,呈負(fù)反饋調(diào)節(jié)端粒的長度.TRF1與端粒DNA結(jié)合后,順式抑制端粒酶的作用,從而控制端粒的長度.端粒酶是一種由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白體,具有逆轉(zhuǎn)錄酶的功能,能夠?qū)⒍肆Ｖ貜?fù)序列TTAGGG加到染色體的末端.大量的惡性腫瘤細(xì)胞表達(dá)端粒酶,而大部分正常細(xì)胞不表達(dá)端粒酶.進(jìn)一步的研究表明,TRF1對端粒酶的表達(dá)和活性沒有影響,由此推測TRF1通過阻止端

3、粒酶在端粒末端的作用來控制端粒長度.與TRF1密切相關(guān)的另一個端粒蛋白是端錨蛋白(Tankyrase 1,TANK1),TANK1可以調(diào)節(jié)體內(nèi)TRF1在端粒的聚集,在端粒酶陽性的細(xì)胞,TANK1長期過表達(dá)可使端粒長度進(jìn)行性地延長,缺失PARP區(qū)域的TANK1對TRF1的分布和端粒長度的動力學(xué)無影響,因而TANK1可能是體內(nèi)端粒延長的一種正調(diào)控因子,通過阻滯TRF1與端粒的結(jié)合發(fā)揮作用.根據(jù)"端粒長度調(diào)節(jié)的蛋白計數(shù)模型",當(dāng)TRF1減少至

4、臨界數(shù)目時,端粒中的TRF1向端粒酶提供的負(fù)反饋信號消失,端粒酶復(fù)合物激活,且脫落的TRF1為端粒酶與端粒的結(jié)合提供了入口,使激活的端粒酶結(jié)合到端粒上并催化合成端粒重復(fù)序列.隨著端粒的延長,其結(jié)合的TRF1重新增至臨界值,再次抑制端粒酶復(fù)合物與端粒的結(jié)合,維持了癌細(xì)胞端粒長度的穩(wěn)定性,從而使癌細(xì)胞持續(xù)生長繁殖.綜上所述,人類端粒的功能需要端粒蛋白的調(diào)控,TRF1具有抑制端粒酶復(fù)合物與端粒結(jié)合的作用,而TANK1能夠清除端粒DNA上的TR

5、F1.因此,GRF1和TANK1有可能成為抑制腫瘤的新靶點.基于以上的認(rèn)識,我們首先對50例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者進(jìn)行端粒酶表達(dá)的檢測,篩選出端粒酶陽性表達(dá)的患者,在此基礎(chǔ)上,分別檢測TRF1在NSCLC患者癌組織及癌旁組織中轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平表達(dá)的差異,并通過免疫組化了解TRF1在癌組織及癌旁組織中的細(xì)胞定位,進(jìn)一步對預(yù)測的核定位序列進(jìn)行檢測.暨希望能通過對TRF1在NSCLC中的一系列檢測研究,獲得端粒結(jié)合蛋白在端粒網(wǎng)絡(luò)調(diào)控

6、中的一個切入點. 第一部分TRF1及TANK1mRNA在端粒酶陽性的非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá) 研究目的:對端粒酶表達(dá)陽性的NSCLC患者進(jìn)一步檢測TRF1、TANKlmRNA表達(dá)水平,并探討其表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性. 研究方法: (1)研究對象2004年11月至2005年11月期間,收集NSCLC患者共50例,所有NSCLC病例均選自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院胸外科住院患者,并經(jīng)病理切片證實;

7、 (2)對50例NSCLC患者首先進(jìn)行免疫組化的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)檢測,篩選出端粒酶陽性患者; (3)對端粒酶表達(dá)陽性的NSCLC患者,采用RT-PCR對TRF1, TANKlmRNA進(jìn)行檢測. 結(jié)論: (1)NSCLC患者中,癌組織中的TRFlmRNA表達(dá)水平比癌旁組織中明顯下降; (2)NSCLC患者中,癌組織中的TRFlmRNA表達(dá)水平與細(xì)胞分化程度相關(guān),低分化的NSCLC患者TRFlmRN

8、A表達(dá)水平比高中分化者明顯降低; (3)NSCLC患者中,癌組織中的TANKlmRNA表達(dá)水平比癌旁組織中明顯升高. 第二部分: TRFl蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá) 研究目的:檢測TRFl蛋白在NSCLC中的表達(dá)水平,探討TRFl蛋白表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系. 研究方法:應(yīng)用Western blot方法檢測NSCLC患者癌組織及癌旁組織中TRFl蛋白表達(dá)水平. 結(jié)論 (1)NSCL

9、C患者中,TRF1蛋白在癌組織中的表達(dá)水平比癌旁組織明顯降低. (2)NSCLC患者中,癌組織的TRF1蛋白表達(dá)水平在不同病理分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、分化程度方面的差異無顯著性. 第三部分TRF1蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的免疫組化定位 研究目的:探討TRF1蛋白在NSCLC中的細(xì)胞定位,為深入了解TRF1在NSCLC中的作用提供依據(jù). 研究方法:免疫組化方法檢測TRF1蛋白在NSCLC中的分布.

10、結(jié)論 (1)免疫組化結(jié)果表明,NSCLC患者中肺癌組織的 FRF1的陽性表達(dá)率為44.44﹪,癌旁組織為50.0﹪; (2)免疫組化結(jié)果表明,NSCLC患者中 FRF1的表達(dá)主要在細(xì)胞漿中,部分呈漿、核表達(dá)雙陽性. 第四部分:非小細(xì)胞肺癌中TRF1蛋白的核定位信號序列檢測 研究目的:探討 FRF1 蛋白在NSCLC中的細(xì)胞核定位信號序列是否存在堿基突變或缺失,為深入了解 TRF1蛋白在NSCLC中的作用提