端粒蛋白Tankyrase和TRF1的研究.pdf

1、衰老，同生長一樣，是細胞的重要生命現(xiàn)象之一。端粒具有穩(wěn)定染色體的功能，端粒長度是控制細胞衰老的“分子鐘”，是細胞衰老、死亡和癌變的重要標志。 端粒酶和端粒蛋白對端粒長度具有調(diào)節(jié)作用。人端粒結(jié)合蛋白(telomererepeatbindingfactor1，TRF1)能夠以二聚體的形式通過其羧基端的myb結(jié)構(gòu)域與端粒DNA結(jié)合，強化端粒的有序結(jié)構(gòu)，使其處于一種“關閉”狀態(tài)，導致端粒酶無法接近端粒末端發(fā)揮作用，過表達的TRF1能使端

2、粒長度逐漸縮短，它是端粒長度的負調(diào)節(jié)因子。同時，長期過表達的端錨聚合酶(TRF1-interacting，ankyrin-relatedADP-ribosepolymerase，tankyrase)與TRF1分子結(jié)合后，通過其PARP活性對TRF1進行聚ADP-核糖基化修飾，阻斷TRF1與端粒DNA的結(jié)合，從而解除TRF1對端粒長度的抑制作用，使端粒處于一種“開放”的狀態(tài)，使端粒長度逐漸延長。因此tankyrase酶活性的調(diào)節(jié)及其與TR

3、F1的相互作用可能是細胞內(nèi)調(diào)控端粒長度的重要方式。 TRF1具有核定位信號，是一個典型的核蛋白，而tankyrse則在胞漿和胞核都有分布，并且它在胞核的分布依賴于TRF1。它們是通過什么機制精細地調(diào)節(jié)端粒的長度?這一過程中是否還有其它分子對它們進行修飾或調(diào)控?如果抑制tankyrase的蛋白表達水平，封閉其功能，阻斷它與TRF1之間的相互作用，是否會強化TRF1對端粒長度的負向調(diào)控功能?反之，如果抑制TRF1的表達水平是否會強化

4、tankyrase的功能或是因為tankyrase的入核能力降低而削弱它的正向調(diào)節(jié)能力?所有的這些情況又將對細胞生長、端粒長度和細胞衰老產(chǎn)生怎樣的影響? 為了對上述問題進行深入研究，我們的工作獲得如下結(jié)果： 1.通過RT-PCR從HeLa細胞中克隆得到TRF1蛋白編碼基因，誘導表達了帶His-tag的TRF1融合蛋白，用純化重組蛋白作為免疫原制備的兔抗血清能夠用于Western-blot和免疫熒光細胞染色檢測多種哺乳動物

5、細胞內(nèi)源性TRF1分子。 2.通過穩(wěn)定過表達與tankyrase結(jié)合的TRF1氨基端68個氨基酸序列，建立了負顯性抑制tankyrase胞核功能的細胞模型。 3.篩選得到兩個干涉tankyrase蛋白表達水平的siRNA序列，獲得了穩(wěn)定表達干涉siRNA序列的細胞株。 4.利用帶GFP-tag的TRF1重組載體，建立TRF1誘導HeLa和H460細胞凋亡的模型。 5.免疫共沉淀試驗顯示：PKA和TRF1能

6、夠形成免疫沉淀復合物，PKA的體外磷酸化實驗表明：PKA能夠?qū)RF1進行磷酸化修飾，并且可被PKA的抑制劑H89所抑制。提示：TRF1可能是PKA的磷酸化底物。 6.通過瞬時共轉(zhuǎn)染，篩選出兩條能夠顯著抑制過表達TRF1的siRNA序列，一條具有抑制作用的siRNA序列。 本研究建立的封閉tankyrase胞核功能的細胞模型和得到的干涉tankyrase及TRF1的siRNA序列，為深入理解tankyrase和TRF1之