熱處理和化學(xué)處理對(duì)梨離體植株中病毒的影響.pdf

1、蘋果莖溝病毒（Apple stem grooving virus, ASGV）和蘋果褪綠葉斑病毒（Applechlorotic leaf spot virus，ACLSV）是梨樹上兩種重要病毒，廣泛分布于世界各梨、蘋果種植區(qū)。在梨樹上這兩種病毒通常不產(chǎn)生明顯的癥狀，但影響樹勢(shì)和降低產(chǎn)量。栽培無(wú)病毒種苗是減輕這些病毒危害的重要途徑，熱處理和化學(xué)處理是獲得無(wú)病毒果樹種質(zhì)的重要途徑。為探索適合這兩種病毒的脫病毒處理?xiàng)l件，建立更加有效的脫病毒技

2、術(shù)，本研究以砂梨離體植株為研究體系，對(duì)熱處理和化學(xué)處理進(jìn)程中ASGV和ACLSV在離體植株及其莖尖的分布動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究，取得如下進(jìn)展。 1．采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和RT-PCR技術(shù)相結(jié)合，對(duì)砂梨‘黃花’的20個(gè)芽系的ASGV和ACLSV，篩選出帶有這兩種病毒的芽系共13個(gè)，通過(guò)在MS培養(yǎng)基上擴(kuò)繁，建立了用于本研究的離體培養(yǎng)體系。 2．采用組織免疫印跡技術(shù)對(duì)ASGV和ACLSV在‘黃花’離體植株莖干各部位分布

3、特點(diǎn)進(jìn)行了分析，通過(guò)改進(jìn)病毒抗體吸附方法和延長(zhǎng)洗滌時(shí)間有效降低了非特異反應(yīng)，根據(jù)最終產(chǎn)生紫色反應(yīng)可以判斷病毒存在部位。采用該方法對(duì)植株縱切面印跡分析的結(jié)果表明，ASGV和ACLSV在‘黃花’離體植株莖干的頂端和基部含量均很高，莖干中部也有病毒分布，但反應(yīng)顏色相對(duì)較淺。 3．合成了這兩種病毒的特異性生物素標(biāo)記探針，建立了病毒斑點(diǎn)雜交和組織印跡原位雜交技術(shù)。采用組織印跡原位雜交技術(shù)對(duì)‘黃化’離體植株莖干縱切面和各部位的橫切面印跡進(jìn)行

4、了病毒檢測(cè)，其結(jié)果與組織免疫印跡相似，但特異性更強(qiáng)，雜交后免疫檢測(cè)產(chǎn)生的紫色反應(yīng)更明顯。 4．采用恒溫（37℃）和變溫（32℃／39℃，8h／16h交替）熱處理技術(shù)對(duì)‘黃化’離體植株進(jìn)行了脫病毒處理，采用以上建立的免疫印跡和組織印跡原位雜交技術(shù)對(duì)處理不同時(shí)間進(jìn)程中植株莖干病毒濃度變化進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，在熱處理過(guò)程中植株莖干病毒含量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，且莖干頂端病毒濃度的變化較基部更大，恒溫處理至35d或變溫處理至50

5、d后，莖尖基本無(wú)病毒產(chǎn)生的特異性紫色反應(yīng)，而這種紫色反應(yīng)在基部仍清晰可見(jiàn)。在處理不同時(shí)期，取1～5mm莖尖（37℃）或0.5～5mm（32℃／39℃）莖尖進(jìn)行了再培養(yǎng)，采用ELISA對(duì)再生植株病毒檢測(cè)的結(jié)果顯示，所取莖尖越小或處理時(shí)間愈長(zhǎng)，ELISA檢測(cè)吸光值愈低，表明隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒含量自莖尖向基部逐漸降低，這種變化趨勢(shì)與組織印跡觀察到的現(xiàn)象一致。ELISA和斑點(diǎn)雜交的結(jié)果表明，恒溫處理35d后取1mm莖尖或變溫處理45d后取

6、0.5mm莖尖可以脫除ASGV和ACLSV。 5．比較熱處理再生植株的ELISA和斑點(diǎn)雜交檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)未處理植株采用ELISA法可以有效檢測(cè)這兩種病毒，而經(jīng)熱處理后，植株體內(nèi)病毒含量降低，此時(shí)需采用更靈敏的斑點(diǎn)雜交技術(shù)以確保獲得無(wú)病毒種質(zhì)。 6．采用組織印跡原位雜交技術(shù)，對(duì)病毒醚處理離體植株莖干病毒含量變化進(jìn)行初步分析的結(jié)果表明，經(jīng)病毒醚處理后，植株體內(nèi)病毒含量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，處理至40d后莖尖病毒濃度明