大鼠腦缺血預適應(yīng)對血漿皮質(zhì)醇含量及Bcl-2、Bax表達的影響.pdf

1、腦血管疾病(cerebrovasculardiseases，CVD)是嚴重危害人民健康的常見病、多發(fā)病，其致殘、致死率較高，因此對CVD的研究具有重大的社會意義。目前，腦保護已成為CVD研究熱點之一。自1990年Kitagawa等發(fā)現(xiàn)腦缺血耐受現(xiàn)象以來，探討腦缺血耐受的分子生物學機制并從中發(fā)現(xiàn)新的腦保護途徑已成為許多學者的研究目標。 腦缺血預適應(yīng)(brainischemicprocondition，BIP)，或稱腦缺血耐受(br

2、ainischemictolerance，BIT)是指腦組織一次或多次短暫性缺血再灌注后，大腦對以后較長時間的缺血性損傷產(chǎn)生顯著的耐受性，表現(xiàn)為腦神經(jīng)細胞死亡明顯減少，腦梗死體積顯著縮小，神經(jīng)功能缺損明顯減輕等。目前研究發(fā)現(xiàn)：持續(xù)性腦缺血或腦缺血再灌注后血漿皮質(zhì)醇含量顯著升高，并且這種內(nèi)源性皮質(zhì)醇升高可加重缺血性腦損害，其機制可能在于下調(diào)Bcl-2蛋白的表達，上調(diào)Bax蛋白的表達，促進Caspase-3蛋白的表達，從而加重腦缺血后神經(jīng)細

3、胞的凋亡。而在對大鼠腦缺血預適應(yīng)后血漿皮質(zhì)醇含量的變化及Bcl-2、Bax的表達有何變化目前尚未見報道。 本實驗擬選取SD大鼠用線栓法制備大腦中動脈局灶性缺血再灌注模型(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)，通過測定大鼠局灶性BIP后血漿皮質(zhì)醇的含量和應(yīng)用免疫組織化學方法觀察大鼠大腦皮層神經(jīng)細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的變化，探討大鼠內(nèi)源性皮質(zhì)醇參與BIP形成的機制，為開發(fā)新的腦保護藥物提供理

4、論依據(jù)。 材料與方法 (1)實驗動物及分組：健康雄性SD大鼠72只，280～350g，隨機分為3組，每組6只，依再灌注時點分為3h、12h、24h、48h4個時點。A組：假手術(shù)組；B組：缺血組(假手術(shù)+缺血再灌注)；C組：缺血預適應(yīng)組(缺血預適應(yīng)+缺血再灌注)。 (2)模型的制作采用ZeaLonga大腦中動脈線栓法并加以改進。缺血預適應(yīng)10min，3d后持續(xù)性缺血2h。假手術(shù)組僅暴露左側(cè)頸總動脈及分叉部，不插線阻

5、塞大腦中動脈。缺血組以假手術(shù)代替缺血預適應(yīng)。 (3)神經(jīng)功能評分：評分參考Longa的5分制。 (4)標本收集及指標檢測：腹主動脈取血4ml，加入裝有100μlEDTA的試管中，在4℃3000r/min狀態(tài)下離心15分鐘，取上清。實驗樣品依試劑盒中步驟依次進行操作，γ-計數(shù)儀測定放射免疫強度。常規(guī)取腦組織甲醛固定、石蠟包埋、切片。采用HE染色和免疫組化SP法，光鏡下檢測大腦皮層免疫陽性細胞數(shù)。 (5)統(tǒng)計分析：應(yīng)

6、用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。以α=0.05作為檢驗水準。 結(jié)果 (1)缺血再灌注模型制成后，缺血組和缺血預適應(yīng)組大鼠均出現(xiàn)不同程度的精神萎靡不振、食欲不振、自潔能力下降，右側(cè)肢體肌力下降，特別以上肢為重，提尾右上肢不能伸展，行走時出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)、追尾或向右側(cè)傾倒現(xiàn)象。缺血預適應(yīng)組大鼠的表現(xiàn)較缺血組顯著輕微。 (2)HE染色：缺血組大腦皮層神經(jīng)細胞空泡變性、壞死較多，正常神經(jīng)細

7、胞少見；缺血預適應(yīng)組較缺血組大腦皮層神經(jīng)細胞空泡變性、壞死少，正常神經(jīng)細胞多見；假手術(shù)組大腦皮層神經(jīng)細胞正常。 (3)神經(jīng)功能評分：缺血預適應(yīng)組大鼠在缺血再灌注后3h、12h、24h、48h神經(jīng)功能評分明顯低于缺血組(P＜0.05)。 (4)血漿皮質(zhì)醇含量測定結(jié)果：缺血預適應(yīng)組在缺血再灌注各時點血漿皮質(zhì)醇含量低于缺血組，統(tǒng)計學結(jié)果有顯著差異(P＜0.05)。 (5)Bcl-2及Bax蛋白表達：缺血預適應(yīng)組大鼠缺血

8、側(cè)大腦皮層Bcl-2蛋白的表達與缺血組、假手術(shù)組相比顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。缺血組大鼠缺血側(cè)大腦皮層Bcl-2蛋白的表達與假手術(shù)組相比也顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。假手術(shù)組大鼠缺血側(cè)大腦皮層有少量Bcl-2蛋白的表達。 缺血組大鼠缺血側(cè)大腦皮層Bax蛋白的表達與缺血預適應(yīng)組、假手術(shù)組相比顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與假手術(shù)組相比，預缺血組大鼠缺血側(cè)大腦皮層Bax蛋白的表達無顯著

9、性差異(P＞0.05)。 結(jié)論 (1)實驗采用線栓法制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型，實驗采用缺血預適應(yīng)10min，3d后持續(xù)性缺血2h的方式，能較好地誘導出腦缺血耐受。 (2)腦缺血預適應(yīng)可以降低大鼠腦缺血再灌注后皮質(zhì)醇的水平，誘導Bcl-2表達上調(diào)、Bax表達下調(diào)，從而抑制缺血側(cè)大腦皮層神經(jīng)細胞的凋亡，減輕大腦皮層神經(jīng)細胞的損傷。 (3)缺血預適應(yīng)后大鼠內(nèi)源性皮質(zhì)醇可能參與了腦缺血耐受的形成，皮質(zhì)醇—