中藥重樓中試提取工藝優(yōu)選及抗腫瘤作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：以傳統(tǒng)抗癌中藥重樓為研究對(duì)象，優(yōu)選最佳中試提取工藝，分離、純化、精制得到抗腫瘤活性單體PCB5-9與PCB4-5，探討重樓皂苷誘導(dǎo)人低分化胃腺癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，以期發(fā)現(xiàn)藥物作用新靶點(diǎn)，為尋求治療腫瘤的新方法奠定基礎(chǔ)。 方法：（1）應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以薯蕷皂苷元得率為考察指標(biāo)，篩選重樓總皂苷的最佳提取工藝條件。以乙醇為提取溶劑提取得浸膏，浸膏水溶液依次經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得重樓總皂苷，然后分別經(jīng)

2、大孔吸附樹(shù)脂柱層析、硅膠柱層析、反相ODS柱層析、RP-HPLC制備色譜制備得重樓皂苷單體成分。（2）采用MTT比色法研究中藥重樓皂苷單體對(duì)腫瘤細(xì)胞株K562、SGC-7901體外增殖反應(yīng)的抑制作用，確定其對(duì)體外培養(yǎng)的K562、SGC-7901細(xì)胞的作用劑量。（3）重樓皂苷單體經(jīng)5（6）-TAMPA-5-maleimide熒光試劑標(biāo)記后，MTI法觀(guān)察重樓皂苷、熒光標(biāo)記的重樓皂苷及游離熒光對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抗腫瘤作用，并采用熒光顯微

3、鏡評(píng)價(jià)該熒光標(biāo)記藥物的細(xì)胞染色情況。（4）瓊脂糖凝膠電泳法觀(guān)察重樓皂苷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞SGC-7901凋亡的作用。（5）應(yīng)用激光共聚焦顯微術(shù)，以鈣離子熒光探針Fluo-3/AM標(biāo)記SGC-7901細(xì)胞內(nèi)鈣離子，觀(guān)察不同濃度的PCB5-9（83-93）作用于癌細(xì)胞10min后，藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度動(dòng)態(tài)變化的影響，并觀(guān)察藥物作用于細(xì)胞24h后，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化。 結(jié)果：（1）重樓皂苷的最佳提取工藝條件為乙醇濃度為70％，提取時(shí)間為

4、5h，料液比為8倍，在此條件下從中提取，分離出重樓皂苷PCB5-9（83-93）與PCB4-5（39-48），經(jīng)進(jìn)一步的分離純化，經(jīng)HPLC歸一化方法鑒定其純度分別為97.63％和91.80％，結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步的鑒定。（2）體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PCB5-9、PCB4-5對(duì)腫瘤細(xì)胞株K562、SGC-7901均有抑制作用，其抑制率與時(shí)間、劑量呈依賴(lài)性關(guān)系。其中，PCB5-9對(duì)K562、SGC-7901細(xì)胞的最高抑制率分別為88.54％和75.0

5、8％；72h的IC50分別為6.55μg/mL與20.48μg/mL；PCB4-5最高抑制率為88.58％和75.68％；72h的IC50分別為5.69μg/mL和4.83μg/mL。（3）熒光標(biāo)記的重樓皂苷體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，標(biāo)記后的重樓皂苷對(duì)SGC-7901細(xì)胞也具有抑制作用，濃度為0.03mmol/l時(shí)，抑制率為52.28％；游離熒光對(duì)腫瘤細(xì)胞沒(méi)有抑制作用，熒光顯微鏡下觀(guān)察標(biāo)記的藥物作用細(xì)胞2.5h后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光。（4）瓊脂

6、糖凝膠電泳結(jié)果顯示從PCB5-9（83-93）處理24h的SGC-7901細(xì)胞中提取的DNA，出現(xiàn)較典型的梯狀電泳條帶，且隨著藥物濃度的升高，條帶亮度增加，10μg/mL藥物組和陽(yáng)性藥順鉑組條帶亮度最高。（5）激光共聚焦顯微觀(guān)察結(jié)果表明不同濃度藥物孵育SGC-7901細(xì)胞10min后，LSCM動(dòng)態(tài)觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)的鈣離子，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有顯著變化，而藥物作用24h后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著升高，且[Ca2+]i隨著藥物濃度的增加而升高。 結(jié)論：