成骨因子NELL1在大鼠股骨牽張成骨中促皮質(zhì)骨生成的研究.pdf

1、目的：為了加速四肢長(zhǎng)骨牽張成骨（DO）過(guò)程中新骨的形成、礦化及塑型改建，將具有特異性促進(jìn)成骨分化及礦化功能的NELL1因子應(yīng)用于大鼠股骨牽張成骨模型，通過(guò)創(chuàng)新性的外固定架設(shè)計(jì)及動(dòng)態(tài)Micro-CT觀察，研究NELL1因子對(duì)股骨牽張成骨的影響，從而為臨床上治療四肢大段骨缺損尋找一種快速有效的治療方法。方法：構(gòu)建同時(shí)攜有綠色熒光蛋白（GFP）報(bào)告基因和NELL1基因的重組腺病毒載體Ad-GFP-NELL1，經(jīng)擴(kuò)增、純化后轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞

2、（BMSCs）觀察其體外對(duì)BMSCs的影響。進(jìn)一步應(yīng)用自行研制的大鼠股骨DO外固定架系統(tǒng)將30只SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組于術(shù)后14天分別于骨延長(zhǎng)局部注射等量Ad-GFP-NELL1、Ad-GFP、生理鹽水，術(shù)后21、28、42、56天麻醉后行X線及活體Micro-CT檢查，并于術(shù)后28天，各組取1只采用小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)NELL1及GFP表達(dá)情況。其余動(dòng)物于術(shù)后56天取材行行生物力學(xué)、組織學(xué)及免疫組化檢測(cè)。結(jié)果：①成功構(gòu)建出A

3、d-GFP-NELL1重組腺病毒，純化后獲得滴度高達(dá)1×1011pfu/ml。②用構(gòu)建好的病毒轉(zhuǎn)染鑒定過(guò)的大鼠BMSCs后，NELL1蛋白及GFP均陽(yáng)性表達(dá)，轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。③Micro-CT動(dòng)態(tài)觀察大鼠股骨DO模型顯示：在靜息期及延長(zhǎng)期，延長(zhǎng)區(qū)無(wú)明顯新骨形成，延長(zhǎng)區(qū)內(nèi)主要為由纖維樣組織組成的假性生長(zhǎng)板結(jié)構(gòu)。在鞏固期前期（術(shù)后21～42天）主要為骨量的增加，表現(xiàn)為骨礦含量增加，骨小梁數(shù)量增多；鞏固后期（術(shù)后42～56天），

4、骨量仍持續(xù)增加，同時(shí)骨的質(zhì)量也開(kāi)始明顯提高，表現(xiàn)為骨小梁增厚，已礦化組織礦化度提高。在術(shù)后56天，延長(zhǎng)區(qū)內(nèi)仍處于成骨和骨結(jié)構(gòu)的改建中，假性生長(zhǎng)板基本消失，未骨化的軟骨組織依然存在。術(shù)后56天，DO側(cè)股骨的最大扭矩及失效能量均小于健側(cè)股骨。④Ad-GFP-NELL1局部應(yīng)用于大鼠DO模型，注射后14天可見(jiàn)延長(zhǎng)區(qū)NELL1蛋白表達(dá)。X線片顯示，術(shù)后56天，Ad-GFP-NELL1組9只延長(zhǎng)區(qū)均達(dá)到骨性愈合，對(duì)照Ad-GFP、生理鹽水組分別為

5、4只、5只達(dá)到骨性愈合。生物力學(xué)測(cè)試Ad-GFP-NELL1組明顯優(yōu)于兩對(duì)照組，與正常股骨的抗扭強(qiáng)度相當(dāng)。Micro-CT數(shù)據(jù)顯示：鞏固期前期3組數(shù)據(jù)無(wú)明顯差異；鞏固后期Ad-GFP-NELL1組骨痂增速減緩，骨體積分?jǐn)?shù)（BVF）增速由前3周每周10％下降到6％。而兩對(duì)照組增加到13～14％。到術(shù)后56天，Ad-GFP-NELL1組骨體積分?jǐn)?shù)（BVF）、礦化組織密度（BMD）均低于兩對(duì)照組。Micro-CT三維重建顯示：到鞏固期后期，A

6、d-GFP-NELL1組生成的骨痂以皮質(zhì)骨為主，松質(zhì)骨較少，骨髓腔貫通，形成了類(lèi)似長(zhǎng)骨管狀骨的結(jié)構(gòu)，兩對(duì)照組形成了較多的骨痂，以松質(zhì)骨為主，改建較差。組織學(xué)切片顯示：兩對(duì)照組延長(zhǎng)區(qū)中央于術(shù)后56天仍有軟骨組織結(jié)構(gòu)，而Ad-GFP-NELL1組未見(jiàn)明顯軟骨組織存留，均為骨痂結(jié)構(gòu)。免疫組化結(jié)果顯示：3組RUNX2、BMP2、BMP7表達(dá)無(wú)明顯差異，Ad-GFP-NELL1組骨鈣素及骨橋蛋白表達(dá)高于兩對(duì)照組。結(jié)論：①構(gòu)建并純化后的重組腺病毒載

7、體Ad-GFP-NELL1可高效轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，并穩(wěn)定表達(dá)NELL1和GFP兩種蛋白；②在大鼠股骨DO延長(zhǎng)結(jié)束后應(yīng)用可透X線的高分子材料固定牽引針可以獲得穩(wěn)定的固定并便于采用Micro-CT活體動(dòng)態(tài)觀察及評(píng)價(jià)DO過(guò)程中新骨的形成；③長(zhǎng)骨牽張成骨中骨量的增加自延長(zhǎng)結(jié)束后開(kāi)始，持續(xù)5周以上，骨質(zhì)量的改建在延長(zhǎng)結(jié)束后2～3周才開(kāi)始，二者的發(fā)生具有時(shí)相性，提示相應(yīng)的干預(yù)手段應(yīng)在不同的時(shí)期進(jìn)行；④NELL1具有促進(jìn)股骨DO過(guò)程中皮質(zhì)骨生成的作

8、用。在牽張成骨的環(huán)境下，NELL1與已應(yīng)用于臨床的BMPs相比，并不是單純的促進(jìn)局部新骨形成的量，而是促進(jìn)缺損局部新骨的形成及骨痂的礦化、改建，形成較少但結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)強(qiáng)度更佳類(lèi)似于長(zhǎng)骨管狀骨結(jié)構(gòu)的骨痂結(jié)構(gòu)，從而加速牽張成骨的愈合。這一結(jié)果改變了過(guò)去認(rèn)為NELL1只在顱骨、下頜骨等神經(jīng)脊來(lái)源骨組織中具有促進(jìn)成骨作用的結(jié)論。提示我們，NELL1因子應(yīng)用于臨床可以縮短四肢牽張成骨術(shù)后患者攜帶外固定架的時(shí)間，有望使?fàn)繌埑晒沁@種治療大段骨缺損的