以siRNA表達載體介導的RNA干涉法建立人細胞色素b5還原酶缺陷的細胞模型.pdf

1、NADH-細胞色素b5還原酶(簡稱b5R)是一種具有重要生理功能的氧化還原酶類，以胞漿可溶型和膜結合型兩種形式存在于體內(nèi)。b5R基因突變將導致隱性先天性高鐵血紅蛋白血癥(RCM)。 本課題利用RNA干涉(RNAi)技術，應用網(wǎng)絡在線軟件設計并合成兩條靶向人b5RmRNA的siRNA模板片段，分別將其克隆至經(jīng)過改建、帶有neo基因的pSilencer1.0-U6載體上，構建成siRNA真核表達載體pSib5R-1和pSib5R-2

2、。重組載體通過酶切和DNA直接測序鑒定。分別將兩種重組質粒脂質體轉染法瞬時轉染人肺成纖維細胞和BEL-7402肝癌細胞株，半定量RT-PCR和熒光定量RT-PCR分析b5RmRNA的表達抑制效率。結果顯示，pSib5R-1對兩種細胞b5R基因的表達無明顯影響，pSib5R-2對成纖維細胞b5RmRNA的抑制率達81.7％，對BEL-7402細胞b5RmRNA的抑制率達60％，說明兩種細胞b5R基因的表達均可被pSib5R-2介導的RNA

3、干涉有效抑制。 對pSib5R-1、pSib5R-2轉染的BEL-7402細胞，采用G418進行篩選，共獲得共獲得18個細胞克?。浩渲锌蛰d體5個，pSib5R-15個，pSib5R-28個。經(jīng)PCR鑒定證實，各個克隆均穩(wěn)定整合有重組載體或空載體。對各穩(wěn)定轉染的細胞克隆在b5RmRNA水平、酶活性、酶含量等方面進行干涉效果的鑒定，結果顯示，pSib5R-2轉染的克隆中有兩個克隆b5RmRNA抑制率達48.2％和56.2％；酶活性抑

4、制率為38.4％和48.5％；酶含量也有明顯降低。對b5R酶缺陷的細胞克隆采用MTT法測定細胞的生長曲線，發(fā)現(xiàn)b5R酶缺陷沒有改變細胞的生長速度。采用MTT法，通過不同濃度的絲裂霉素以及絲裂霉素處理后的不同時間點對b5R酶缺陷和正常的BEL-7402細胞的生長抑制率進行比較，發(fā)現(xiàn)b5R酶缺陷并沒有降低絲裂霉素抑制BEL-7402細胞的敏感性。 本研究成功構建了b5RsiRNA表達載體，建立b5R酶缺陷的BEL-7402的細胞模型