動(dòng)脈硬化關(guān)鍵信號(hào)分子相關(guān)的血清microRNA在亞臨床甲減病人中表達(dá)譜初探.pdf

1、背景：
　　亞臨床甲狀腺功能減退癥(Subclinical hypothyroidism，SCH)（簡(jiǎn)稱亞臨床甲減）是指血清促甲狀腺激素（Thyroid-stimulating hormone，TSH）水平高于正常上限，而血清游離甲狀腺激素水平FT4(free T4)及血清游離三碘甲狀腺原氨酸水平FT3(free T3)在正常范圍為特點(diǎn)的甲狀腺功能紊亂。發(fā)病率隨年齡增加，在普通人群中發(fā)病率約5-15％，但在74歲以上的人群中發(fā)病率

2、達(dá)到高峰:男性約16％，女性約21％。大量的研究表明，TSH存在廣泛的甲狀腺外作用，尤其對(duì)血管的損傷越來越受到關(guān)注，研究表明亞臨床甲減可通過脂代謝紊亂，內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷，氧化應(yīng)激等誘發(fā)或加重動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，ATH），是心血管疾病的潛在危險(xiǎn)因素。但另有大型追蹤研究未發(fā)現(xiàn)亞臨床甲狀腺功能減退與動(dòng)脈硬化相關(guān)。到目前為止，亞臨床甲狀腺功能減退對(duì)動(dòng)脈硬化的影響還未達(dá)成共識(shí)，存在爭(zhēng)議。因此有必要多角度探討亞臨床甲減與動(dòng)

3、脈硬化的相關(guān)性，為亞臨床甲減病人的防治工作尋找理論依據(jù)。
　　MicroRNAs(簡(jiǎn)寫為miRNAs，miRs)是一組內(nèi)源性、功能性的非編碼小RNA片段，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA穩(wěn)定存在于人的體液及血液系統(tǒng)中，具有很好的穩(wěn)定性、可重復(fù)性，能夠從外周血中穩(wěn)定檢測(cè)，具有生物學(xué)標(biāo)記的優(yōu)良特點(diǎn)。已經(jīng)證實(shí)miRNAs在包括動(dòng)脈硬化等多種人類疾病中具有重要意義，而且其表達(dá)水平呈現(xiàn)出器官特異性及組織特異性。特定的microRNA表達(dá)

4、譜的變化提示著體內(nèi)特定的病理、生理過程。
　　本研究首次對(duì)初發(fā)亞臨床甲狀腺功能減退癥患者中6個(gè)動(dòng)脈硬化關(guān)鍵信號(hào)分子相關(guān)的microRNA的表達(dá)譜進(jìn)行了初步探討，從一新的角度重新為亞甲減與動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性進(jìn)行了評(píng)估。通過文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，與動(dòng)脈硬化發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)的6個(gè)血清microRNAs納入本研究:其中miR-21-3p可以促進(jìn)血管平滑肌增殖，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化;miR-125a-5p與氧化低密度脂蛋白等血管炎性反應(yīng)密切相關(guān);

5、miR-126-3p與血管穩(wěn)定性、完整性和粘附分子的表達(dá)密切相關(guān);miR-210在缺氧狀態(tài)下可促進(jìn)血管增殖，是缺氧特異性microRNA;miR-221-3p及miR-222-3p具有抗血管增殖作用，抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移，增殖，及血管生成作用。
　　研究目的：
　?、俪醪教接憗喤R床甲減人群中動(dòng)脈硬化關(guān)鍵信號(hào)分子相關(guān)的microRNA的表達(dá)譜變化，進(jìn)一步從新的角度探討亞臨床甲減與動(dòng)脈硬化的相關(guān)性。
　　②進(jìn)一步分析動(dòng)脈硬化關(guān)

6、鍵microRNA表達(dá)水平與TSH水平、血脂水平及頸動(dòng)脈內(nèi)膜的相關(guān)性。
　　③探索6個(gè)血清microRNAs整體表達(dá)模式，尋找分別在亞臨床甲減人群中及動(dòng)脈硬化人群中最具特異性表達(dá)的microRNA。
　　研究對(duì)象與方法：
　　診斷:①亞臨床甲狀腺功能減退癥的診斷參考國際通用標(biāo)準(zhǔn)和中國甲狀腺疾病診斷指南，即TSH水平升高超過正常上限而游離甲狀腺素水平包括游離甲狀腺三碘原氨酸(FT3)和游離甲狀腺素(FT4)正常。

7、　　②頸動(dòng)脈內(nèi)中膜增厚診斷標(biāo)準(zhǔn)參照國際超聲目前常用診斷標(biāo)準(zhǔn)和2010中國高血壓病防治指南，即最大頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度小于0.9毫米(max-IMT＜0.9mm)定義為正常，最大頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度大于0.9毫米(max-IMT＞0.9mm)定義為頸動(dòng)脈內(nèi)中膜增厚，最大頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度大于1.3毫米(max-IMT＞1.3mm)定義為頸動(dòng)脈內(nèi)膜粥樣斑塊形成。
　　③血脂異常的診斷標(biāo)準(zhǔn)按NCEP/ATPⅢ(the National Chole

8、sterol Education Program Adult Treatment Panel Ⅲ)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。
　　研究對(duì)象：健康對(duì)照人群22例(NC，n=22);單純亞臨床甲減病人20例(SCH，n=20);亞臨床甲減伴有頸動(dòng)脈內(nèi)中膜增厚的病人21例(SCH+ATH，n=21)。頸動(dòng)脈硬化不伴亞臨床甲減患者22例(ATH，n=22)。
　　研究方法：搜集每個(gè)研究對(duì)象基本臨床資料;超聲測(cè)量頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度;留取血標(biāo)本進(jìn)行生化

9、指標(biāo)即甲狀腺功能檢測(cè);采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法確定每個(gè)研究對(duì)象血清微小RNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　統(tǒng)計(jì)分析：連續(xù)性變量數(shù)據(jù)以均數(shù)±SEM表示，非連續(xù)性分類變量以原始數(shù)據(jù)表示。變量的正態(tài)分布采用Shapiro-Wilk test進(jìn)行檢測(cè)。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單向方差分析(ANOVA)和LSD多重比較。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行Kruskal-Wallis test檢驗(yàn)和Mann-Whitney U檢驗(yàn)。性別分布采用R*C表列聯(lián)分析進(jìn)行比較。

10、采用Spearman相關(guān)分析TSH，血脂，miRNAs與頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度等變量間的相關(guān)性。miRNA整體表達(dá)模式的凝聚層次聚類分析采用Cluster version 3.0和Java Treeview 1.60，采用平均歐式距離來丈量組間最近距離。基于microRNA表達(dá)水平的工作特征(ROC)曲線分析分別用于不同microRNA識(shí)別亞甲減病人和動(dòng)脈粥樣硬化病人的識(shí)別效力評(píng)價(jià)分析。所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均

11、為雙側(cè)，差異顯著性水平定義為p＜0.05。
　　研究結(jié)果：
　　一般資料比較:總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和甘油三酯水平(TG)在SCH組，SCH+ATH組和ATH組顯著高于正常對(duì)照組(p＜0.05）;SCH+ATH組患者TC及LDL-C水平顯著高于單純SCH組(p＜0.05）;而總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)和甘油三酯水平(TG)在SCH+ATH組和ATH組無顯著差異(p＞0.05）。<

12、br>　　入選的6個(gè)microRNAs的相對(duì)表達(dá)量組間比較:miR-21-5p相對(duì)表達(dá)量在SCH組(1.842±0.221)、SCH+ATH組(2.447±0.102)和ATH組(1.654+0.171)患者中表達(dá)量顯著高于NC組(0.912±0.274)，(p＜0.05）;在SCH+ATH組表達(dá)量顯著高于SCH組和ATH組(p＜0.05）。miR210在各組間的表達(dá)豐度都極低，未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。miR-125a-5p以及

13、miR-126-3p從NC組(分別為0.053±0.234和1.125±0.211)到SCH組(分別為-0.732±0.206和-0.279±0.247)再到SCH+ATH組(分別為-1.895±0.220和-1.257±0.219)或ATH(分別為-2.290±0.223和-1.232±0.289)呈逐步降低的趨勢(shì)(p＜0.05），但在ATH+SCH組及ATH組表達(dá)水平無顯著差異(p＞0.05)。與抗血管增殖作用相關(guān)的miR-221-

14、3p和miR-222-3p在SCH+ATH組(分別為-2.466±0.142和-2.636±0.128)和ATH組(分別為-2.323±0.197和-2.628±0.208)，表達(dá)水平較NC組(分別為-1.276±0.160和-1.392±0.203)，(p＜0.05，p＜0.05)和SCH組(分別為-1.368±0.110和-1.563±0.125)顯著下調(diào)(p＜0.05，p＜0.05)，而在正常組(NC)和亞臨床甲減組(SCH)之間

15、以及ATH組和SCH+ATH組之間不存在顯著差異(p＞0.05，p＞0.05)。
　　相關(guān)分析:log2mir-21-5p與TSH水平和max-IMT（最大頸動(dòng)脈內(nèi)中膜）呈正相關(guān)，與血脂水平無明顯相關(guān)。log2miR-125a-5p、log2miR-126-3p、log2miR-221-3p和log2miR-222-3p均與血脂水平、TSH水平和頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。log2miR-210與血脂水平、TSH水平以及頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚

16、度之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。
　　基于差異表達(dá)的5個(gè)血清目標(biāo)miRNA分層凝聚聚類分析:結(jié)果顯示基于差異表達(dá)的5個(gè)血清目標(biāo)miRNA分層凝聚聚類分析可將各組大部分個(gè)體聚在一起，22個(gè)正常人(NC)中16個(gè)聚在一起;20個(gè)SCH患者15個(gè)聚在一起;21例SCH+ATH患者中16個(gè)聚集在一起以及22例ATH病人中18例聚在一起。
　　ROC曲線分析顯示:miR-21-5p在識(shí)別亞臨床甲減病人時(shí)曲線下面積AUC:0.762(95％CI，0

17、.658-0.865)，在6個(gè)目的microRNA中最大。而miR-126-3p在識(shí)別所有動(dòng)脈硬化病人時(shí)曲線下面積AUC:0.888(95％CI，0.819-0.958)，在6個(gè)目的microRNA中最大。
　　結(jié)論：
　?、賱?dòng)脈硬化關(guān)鍵病理生理過程相關(guān)的血清微小RNA在亞臨床甲減病人中存在特異性表達(dá)異常，并且與TC、TG、LDL-C、TSH水平和動(dòng)脈內(nèi)膜厚度存在相關(guān)性。
　?、贛icroRNA-21-5p在亞臨床甲減