糖尿病腎病腎小球細胞間相互作用——氧化應激、血小板源性生長因子與系膜細胞.pdf

1、研究目的: 1.建立大鼠原代腎小球系膜細胞的體外培養(yǎng)方法，為體外研究腎小球生物學行為提供細胞模型。 2.觀察高糖對體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞氧化平衡、血小板源性生長因子(PDGF)和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)表達的影響以及茶多酚的干預作用，探討糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的機制以及茶多酚對糖尿病腎病的防治作用。 3.通過系膜細胞和內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)法，證實在高糖條件下兩種細胞問存在異常相互作用和活化內(nèi)皮細胞對異常相互作用的影響

2、，并這種異常的相互作用對系膜細胞表達PDGF和NF-κB的影響及其在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展中的作用。 研究方法: 1.使用Ⅳ型膠原酶消化法和腎小球分級過篩法分離、培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞，通過形態(tài)學觀察、直接免疫熒光法和免疫細胞化學法鑒定。 2.系膜細胞單獨培養(yǎng)：系膜細胞分別在對照糖濃度(5.5mmol/L)、高糖濃度(25mmol/L)和抗氧化劑茶多酚干預的條件下培養(yǎng)0h、12h、24h、36h、48h，借助紫外分

3、光光度法、免疫細胞化學、RT-PCR和WesternBlotting等方法檢測細胞培養(yǎng)上清液還原型谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性、細胞內(nèi)血小板源性生長因子-B(PDGF-B)mRNA及蛋白與核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κBp65)蛋白的表達情況。 3.建立系膜細胞與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)：將內(nèi)皮細胞預先在正常糖或高糖條件下培養(yǎng)24h，再與系膜細胞共同培養(yǎng)。實驗分為正常對照組、高糖組和茶多酚干預組。采用紫外分光光度法檢測各組上清液中GSH-

4、PX活性，RT-PCR和WesternBlotting技術(shù)檢測系膜細胞PDGF-BmRNA及蛋白與NF-κBp65蛋白的表達情況。 研究結(jié)果: 1.成功培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞。該細胞呈長梭形或不規(guī)則形，待細胞生長至90％融合即可傳代。傳代后細胞純度極高，生長情況良好。直接免疫熒光染色抗Vimentin陽性、抗CD34陰性，免疫細胞化學染色抗Cytokeratin陰性。 2.系膜細胞單獨培養(yǎng)時，高糖組的GSH-PX

5、活性低于正常對照組；經(jīng)茶多酚干預后GSH-PX活性增加。與正常對照組相比，高糖可使培養(yǎng)的系膜細胞PDGF-BmRNA和蛋白、NF-κBp65蛋白表達增加，茶多酚則能顯著抑制這一上調(diào)作用。 3.經(jīng)高糖預處理的內(nèi)皮細胞與系膜細胞共培養(yǎng)時，高糖組上清液GSH-PX活力比正常對照組顯著降低，給予茶多酚后有所提高；高糖亦可增加共同培養(yǎng)的系膜細胞PDGF-BmRNA和蛋白、NF-κBp65蛋白的表達，茶多酚可逆轉(zhuǎn)高糖的作用。上述現(xiàn)象的改變均

6、比未經(jīng)高糖預處理的內(nèi)皮細胞與系膜細胞共同培養(yǎng)更加明顯。 研究結(jié)論: 1.通過Ⅳ型膠原酶消化法和腎小球分級過篩法可以培養(yǎng)出大鼠腎小球系膜細胞，在體外細胞生長良好，可傳3～6代。 2.高糖使單獨培養(yǎng)的系膜細胞內(nèi)抗氧化酶GSH-PX活性下降，引起細胞內(nèi)氧化失衡，增加促硬化因子PDGF-B的表達，促進腎小球硬化。 3.被高糖活化的內(nèi)皮細胞能促進共培養(yǎng)的系膜細胞GSH-PX活性下降、PDGF-B表達上調(diào)，增強高糖條

7、件下二者的異常相互作用，促進糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。 4.高糖可能通過NF-κB途徑促進系膜細胞PDGF-B表達增加和兩種細胞間的異常相互作用。 5.茶多酚通過減少細胞活性氧(ROS)的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)細胞氧化平衡和減少促硬化因子表達，抑制NF-κB途徑，保護系膜細胞，干預內(nèi)皮細胞與系膜細胞的異常相互作用，對延緩糖尿病腎病的進展有一定的作用。 6.與單獨培養(yǎng)系膜細胞相比，系膜細胞與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)模型能更好地模擬體內(nèi)的真