PP4c干擾后對(duì)大鼠垂體泌乳素瘤細(xì)胞增殖和多巴胺受體表達(dá)的影響.pdf

1、垂體泌乳素瘤是最常見的具有內(nèi)分泌功能的垂體瘤，約占垂體瘤總數(shù)的4596左右。近年的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，泌乳素瘤的發(fā)生率在女性高達(dá)1／1050，在男性也高達(dá)1／2800。PP4(蛋白磷酸酶4)是一種絲／蘇氨酸殘基蛋白磷酸酶，其功能主要是對(duì)磷酸化的某些蛋白質(zhì)進(jìn)行去磷酸化，使之功能發(fā)生變化。本課題組主要成員已經(jīng)成功建立了正常人下丘腦一垂體一腎上腺軸的基因表達(dá)譜，并已采用cDNA微陣列雜交和ESTs大規(guī)模測(cè)序的方法建立了人垂體瘤和其他內(nèi)分泌腫瘤組

2、織的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)相對(duì)正常垂體組織而言，泌乳素瘤組織中PP4的表達(dá)明顯升高，并經(jīng)Realtime—PCR初步證實(shí)，提示PP4可能在垂體泌乳素瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用，但這方面的確切機(jī)制在國內(nèi)外尚未有相關(guān)研究報(bào)道。本試驗(yàn)旨在通過小RNA干擾技術(shù)探討PP4對(duì)泌乳素瘤細(xì)胞增殖活性和多巴胺受體表達(dá)的影響。 第一部分 PP4csiRNA對(duì)MMQ細(xì)胞PP4e基因表達(dá)的干擾作用 目的：應(yīng)用小RNA干擾技術(shù)研究設(shè)計(jì)的三條PP

3、4csiRNA序列對(duì)MMQ細(xì)胞PP4c基因表達(dá)的干擾作用。 方法：掃描PP4cmRMA的全序列(序列號(hào)為NM_134359)，從AUG啟動(dòng)子開始記錄含從雙核苷酸的19個(gè)核苷酸肽作為潛在作用靶點(diǎn)，含量控制在30％－50％，并用BLAST分析排除與其它基因有高度同源性的序列。本試驗(yàn)用Ambion公司設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)并合成3條含21個(gè)堿基的siRNA(siRNAl，siRNA2，siRNA3)及隨機(jī)陰性對(duì)照(siRNAcon)。在SiPO

4、RTNeoFX介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染MMQ細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染后24h，48h，72h收集細(xì)胞，用半定量RT一PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PP4cmRNA的變化，WesternBlot檢測(cè)PP4c蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果：體外合成的三條siRNA通過SiPORTNeoFX轉(zhuǎn)染后，siRNAI抑制PP4c表達(dá)的作用最強(qiáng)，MMQ細(xì)胞表達(dá)的PP4c在轉(zhuǎn)染后24h開始抑制，48h抑制作用最明顯，72h抑制作用開始減弱。單用siPORTNeoFX轉(zhuǎn)染與siRNAc

5、on轉(zhuǎn)染均不會(huì)明顯抑制PP4c的表達(dá)。 結(jié)論：PP4csiRNAl通過降低PP4cmRNA水平特異性抑制PP4c蛋白表達(dá)的效率最高。 第二部分 小RNA干擾抑制PP4c表達(dá)對(duì)刪Q細(xì)胞增殖和凋亡的影響目的：通過小RNA干擾技術(shù)研究PP4c表達(dá)抑制后對(duì)MMQ細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 方法：選用抑制作用最強(qiáng)的PP4csiRNAl序列進(jìn)行功能研究。用MTT法觀察抑制PP4c表達(dá)對(duì)MMQ細(xì)胞增殖活性的影響。通過P工單

6、染法和AnnexinV/PI雙染法用流式細(xì)胞儀檢測(cè)抑制PP4c表達(dá)對(duì)MMQ細(xì)胞凋亡的影響，用比色法測(cè)定抑制PP4c的表達(dá)對(duì)caspase3活性的影響。 結(jié)果：PP4c小RNA干擾24小時(shí)后對(duì)MMQ細(xì)胞增殖有顯著抑制作用，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)刪Q細(xì)胞增殖活性的抑制作用逐漸增強(qiáng)，48小時(shí)抑制作用最強(qiáng)[空白對(duì)照組00值為0．83±0．07，PP4c干擾組為0．49+0．08，p

7、P4c表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期沒有明顯影響，但可誘導(dǎo)出現(xiàn)sub～G1峰，MMQ細(xì)胞的凋亡比例為(10．08±2．15)％，明顯高于空白對(duì)照組[(0．00±0．14)％，p

8、37±0．007，P

9、T—PCR和Western—Blotting法觀察抑制PP4c表達(dá)對(duì)多巴胺受體(D2R)mRNA和蛋白水平的影響。PP4csiRNA后分別抽提MMQ細(xì)胞胞漿蛋白和胞核蛋白用Western—Blotting法觀察NF一KBp65的分布和IKB的表達(dá)，用EMSA的方法觀察抑制PP4c表達(dá)對(duì)NF一KB轉(zhuǎn)錄活性的影響。用時(shí)間分辨熒光免疫分析法檢測(cè)細(xì)胞分泌PRL的變化。 結(jié)果：PP4c小RNA干擾48小時(shí)后促進(jìn)MMQ細(xì)胞多巴胺受體(D2R

10、)mRNA和蛋白水平的表達(dá)。PP4csiRNA后NF-KBp65在細(xì)胞核中的表達(dá)增加，IKB在細(xì)胞漿中表達(dá)減少。EMSA法觀察到PP4csi組細(xì)胞DNA結(jié)合的標(biāo)記電泳帶明顯增加，與p65蛋白抗體同時(shí)孵育發(fā)現(xiàn)有supershift條帶。PP4csiRNA+低劑量BC組細(xì)胞PRL分泌顯著減少[空白對(duì)照組為(39．65~13)ng／ml，PP4csiRNA+BC組為(17．17~8．7)ng／na，p