2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、微囊化細(xì)胞移植利用微囊的免疫保護(hù)作用和良好的生物相容性及滲透能力,為解決移植物來(lái)源短缺問(wèn)題提供了新途徑。微囊化胰島、肝細(xì)胞、甲狀旁腺細(xì)胞、垂體細(xì)胞和胸腺上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞移植的實(shí)驗(yàn)研究均取得了不同程度的進(jìn)展。微囊化基因工程細(xì)胞技術(shù)是微囊化技術(shù)與基因工程技術(shù)的有機(jī)結(jié)合,使基因工程細(xì)胞借助微囊的免疫隔離作用在受體體內(nèi)長(zhǎng)期存活,并持續(xù)表達(dá)目的蛋白,有助于克服傳統(tǒng)基因工程藥物半衰期短,活性不高等缺點(diǎn),相對(duì)于基因治療則具有不改變受體基因組,更加安

2、全,且可以批量生產(chǎn),凍存后隨時(shí)移植給所需患者,降低工作量與成本的優(yōu)點(diǎn)。多項(xiàng)利用微囊化基因工程細(xì)胞治療惡性腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究已顯示出良好的抗腫瘤效果,為腫瘤生物治療提供了一條行之有效的新途徑。 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)是一類鋅離子依賴性的內(nèi)肽酶,可以通過(guò)參與細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解或激活過(guò)程來(lái)調(diào)控細(xì)胞與細(xì)胞之間,以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用,從而廣泛參與細(xì)胞存活、增殖、分

3、化與遷移等多種行為的調(diào)節(jié)?;|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissueinhibitorsofmetalloproteinases,TIMPs)是特異性內(nèi)源MMPs抑制劑,兩者之間平衡的改變?cè)谘苄纬?,以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移等過(guò)程中均發(fā)揮非常重要的作用?,F(xiàn)在普遍認(rèn)為T(mén)IMPx是一類多功能蛋白,其作用機(jī)制包括對(duì)不同MMPs抑制/活化的間接作用,以及通過(guò)非MMPs依賴機(jī)制直接作用于細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的效應(yīng)。TIMP-2分子量為21kDa,低濃度時(shí)

4、參與MMP-2激活,高濃度則可以抑制所有MMPs的活性,尤其對(duì)MT1-MMP、MMP-2、MMP-9具有抑制作用。近期發(fā)現(xiàn)TIMP-2還可以通過(guò)α3β1整合素介導(dǎo)直接抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。研究證實(shí)腺病毒以及非病毒載體介導(dǎo)的TIMP-2基因治療對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)及血管形成有明顯的抑制作用。結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的裸鼠模型證實(shí)肝細(xì)胞預(yù)先轉(zhuǎn)染TIMP-2可以使轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著降低,而對(duì)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝組織進(jìn)行轉(zhuǎn)染則可以抑制轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)。 本研究以pcDN

5、A3質(zhì)粒為載體構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/TIMP-2,采用脂質(zhì)體方法將重組質(zhì)粒DNA導(dǎo)入CHO細(xì)胞,對(duì)G418篩選獲得的穩(wěn)定表達(dá)TIMP-2細(xì)胞CHO/pcDNA3/TIMP-2進(jìn)行微囊化包裹制備微囊化釋放TIMP-2細(xì)胞,對(duì)其體外、體內(nèi)生物學(xué)特性及抗腫瘤作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,探索其應(yīng)用于腫瘤生物治療的可行性。 第一部分TIMP-2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胚肺成纖維細(xì)胞,按TRLZOL方法提取總RNA;采用一步法RT-

6、PCR擴(kuò)增TIMP-2cDNA片段;產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的片段,使之與T-A克隆載體pMD18-T連接構(gòu)建克隆載體pMD18-T/TIMP-2;轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌,挑取白色單克隆細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng);提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切鑒定,鑒定陽(yáng)性者進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序鑒定;將測(cè)序正確的質(zhì)粒pMD18-T/TIMP-2與pcDNA3分別用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切;酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收純化進(jìn)行連接,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcD

7、NA3/TIMP-2;轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌,篩選培養(yǎng)氨芐青霉素抗性克隆;抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR初步鑒定;陽(yáng)性者進(jìn)一步用EcoRⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定。序列測(cè)定及酶切鑒定結(jié)果顯示TIMP-2真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/TIMP-2構(gòu)建正確。 第二部分表達(dá)TIMP-2細(xì)胞株的建立取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞,應(yīng)用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒pcDNA3/TIMP-2與質(zhì)粒pcDNA3進(jìn)行轉(zhuǎn)染;加入G418篩選抗性細(xì)胞克??;用消毒濾紙片吸取消

8、化液消化吸附細(xì)胞克隆,分別擴(kuò)大培養(yǎng);采用RT-PCR方法檢測(cè)目的基因mRNA水平的表達(dá);收集細(xì)胞培養(yǎng)液采用Westernblot及ELISA方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞TIMP-2蛋白的表達(dá);反向酶譜法檢測(cè)TIMP-2蛋白的生物學(xué)活性。RT-PCR顯示TIMP-2在轉(zhuǎn)染細(xì)胞mRNA水平的表達(dá),Westernblot及ELISA檢測(cè)證實(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)TIMP-2蛋白,所表達(dá)的TIMP-2蛋白具有抑制MMPs的活性,表明CHO細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染TIMP-2基因

9、并穩(wěn)定表達(dá)具有生物學(xué)活性的TIMP-2蛋白。 第三部分微囊化釋放TIMP-2細(xì)胞的制各及體外活性研究利用海藻酸鈉,按照一步成囊法包裹基因工程細(xì)胞CHO/pcDNA3/TIMP-2,對(duì)微囊化細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)并觀察其形態(tài);采用MTT方法檢測(cè)微囊化細(xì)胞的活性;ELISA方法檢測(cè)微囊化細(xì)胞中TIMP-2的表達(dá)及釋放;反向酶譜分析檢測(cè)微囊化細(xì)胞釋放TIMP-2蛋白的生物學(xué)活性;以DMSO為保護(hù)劑對(duì)微囊化細(xì)胞進(jìn)行凍存研究;分別用MTT方法和

10、細(xì)胞刮除法觀察微囊化CHO/pcDNA3/TIMP-2細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增殖與遷移運(yùn)動(dòng)的影響。結(jié)果顯示所制備的微囊直徑300~600μm,呈規(guī)則球形,囊內(nèi)包裹的CHO/pcDNA3/TIMP-2細(xì)胞在所觀察的6周內(nèi)存活良好并保持增殖;微囊對(duì)TIMP-2蛋白的表達(dá)釋放及其活性無(wú)影響,制備早期隨著囊內(nèi)細(xì)胞的增殖,相同數(shù)量的微囊TIMP-2的表達(dá)與釋放呈升高趨勢(shì);經(jīng)凍存、復(fù)蘇后微囊化細(xì)胞能保持微囊的形態(tài)及囊內(nèi)細(xì)胞的活性;微囊化CHO

11、/pcDNA3MP-2細(xì)胞對(duì)bFGF刺激的內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及內(nèi)皮細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)具有抑制作用。 第四部分微囊化CHO/pcDNA3/TIMP-2細(xì)胞體內(nèi)移植及抗腫瘤研究用生理鹽水洗滌并懸浮微囊化CHO/pcDNA3/TIMP-2細(xì)胞,用注射器注入BALB/c小鼠的腹腔。定期處死小鼠用生理鹽水沖洗腹腔回收微囊化細(xì)胞進(jìn)行再培養(yǎng)。倒置光學(xué)顯微鏡下觀察回收微囊化細(xì)胞的形態(tài),用ELISA方法檢測(cè)回收微囊化細(xì)胞TIMP-2的表達(dá)與釋放。接受微囊

12、化細(xì)胞移植的小鼠生長(zhǎng)狀況良好。自小鼠體內(nèi)回收的微囊無(wú)明顯變形,形態(tài)完整,表面光滑,無(wú)纖維化表現(xiàn)。移植4周后回收的微囊,其中包裹的細(xì)胞數(shù)量增多,部分聚集形成細(xì)胞團(tuán)。移植1周、2周、4周后回收的微囊化細(xì)胞,其TIMP-2的表達(dá)與釋放呈下降趨勢(shì)。 調(diào)整H22小鼠肝癌細(xì)胞數(shù),于BALB/c小鼠右側(cè)脅部進(jìn)行無(wú)菌皮下接種,每只接種細(xì)胞約1×106個(gè)。3天后將接種成功的小鼠隨機(jī)分為3組,第一組于腫瘤旁皮下注射微囊化CHO/pcDNA3/TIM

13、P-2細(xì)胞;第二組以相同的方法皮下注射微囊化CHO/pcDNA3細(xì)胞;第三組于腫瘤旁皮下注射生理鹽水。干預(yù)治療21天后處死荷瘤鼠,取出腫瘤稱取重量,計(jì)算抑瘤率:抑瘤率=(對(duì)照組瘤重—治療組瘤重)/對(duì)照組瘤重×100%。對(duì)各組小鼠肺臟與腫瘤組織進(jìn)行常規(guī)HE染色病理學(xué)檢查,采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤組織的MVD。結(jié)果顯示微囊化CHO/pcDNA3/TIMP-2細(xì)胞治療組小鼠瘤重顯著低于其它兩組,其抑瘤率為22.8%。微囊化CHO/pcDN

14、A3/TIMP-2細(xì)胞組腫瘤組織壞死灶增多,血管減少。各組小鼠肺組織未見(jiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶。MVD計(jì)數(shù)結(jié)果微囊化CHO/pcDNA3/TIMP-2細(xì)胞組顯著低于其它兩組,表明微囊化CHO/pcDNA3/TIMP-2細(xì)胞對(duì)腫瘤血管形成具有抑制作用。 結(jié)論:1.成功構(gòu)建TIMP-2真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/TIMP-2,并建立穩(wěn)定表達(dá)具有生物學(xué)活性的TIMP-2蛋白的基因工程細(xì)胞CHO/pcDNA3/TIMP-2。 2.以海藻酸鈉為

15、材料,應(yīng)用本所自行研制的微囊發(fā)生器可以獲得直徑300~600μm、呈規(guī)則球形的海藻酸鋇微囊。微囊能保證囊內(nèi)包裹細(xì)胞的存活與增殖,對(duì)TIMP-2蛋白的表達(dá)釋放及其活性無(wú)影響。 3.以DMSO為保護(hù)劑對(duì)微囊化細(xì)胞進(jìn)行凍存,能保持微囊的形態(tài)及囊內(nèi)細(xì)胞的活性。 4.微囊化釋放TIMP-2細(xì)胞對(duì)bFGF刺激的內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及內(nèi)皮細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)具有抑制作用。 5.微囊化CHO/pcDNA3/TIMP-2細(xì)胞在體內(nèi)移植4周內(nèi)表

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