腦神康膠囊對(duì)糖尿病大鼠記憶能力及海馬HIF-1α表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　 研究腦神康膠囊對(duì)糖尿病大鼠記憶能力及海馬乏氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)表達(dá)的影響。
　　 方法:
　　 1.糖尿病大鼠模型制備36只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病組和中藥治療組，糖尿病組和中藥治療組造模之前用高蛋氨酸高膽固醇飼料飼喂2周。造模前所有大鼠禁食不禁水16 h，將糖尿病組和中藥治療組大鼠按60 mg/kg劑量單次腹腔注射1％STZ溶液，72 h后尾靜脈采血測血糖，非空腹血

2、糖值＞16.67 mmol/L者為造模成功。正常對(duì)照組大鼠單次腹腔注射等劑量緩沖液，其余操作同其他兩組。中藥治療組用腦神康膠囊水溶液灌胃，其余兩組用等量生理鹽水灌胃，每日1次，持續(xù)12周。
　　 2.一般狀態(tài)觀察觀察各組大鼠每天的飲食量、一般狀況、精神狀態(tài)、大小便量等，記錄大鼠在0、4、8、12周的體重變化。
　　 3.BAEP實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前把動(dòng)物麻醉，皮下針刺定點(diǎn)感應(yīng)，記錄電極放于兩耳連線中點(diǎn)處皮下，參考電極放于同側(cè)乳突后

3、方皮下，地極固定于尾部。單耳給聲80 HZ聲波刺激，波形疊加1000次，左右耳分別測試、記錄，以絕對(duì)值(ms)表示。在0、4、8、12周各進(jìn)行1次，記錄Ⅱ波、Ⅴ波PL及Ⅲ-ⅤIPL值。
　　 4.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)第一部分是學(xué)習(xí)的過程。將迷宮水池均分為4個(gè)象限，每個(gè)象限設(shè)1個(gè)標(biāo)志點(diǎn)，把平臺(tái)設(shè)定在某一象限。實(shí)驗(yàn)時(shí)將動(dòng)物從既定入水點(diǎn)面向池壁放入水池，游泳時(shí)限設(shè)為60 s，超過60 s未找到平臺(tái)者由實(shí)驗(yàn)員將其引導(dǎo)至平臺(tái)上，動(dòng)物

4、找到平臺(tái)后停留15 s以加強(qiáng)對(duì)空間位置的記憶。此部分共進(jìn)行5天，每天4次。第二部分是測試記憶能力的過程。在第6天時(shí)把平臺(tái)撤除，將動(dòng)物在訓(xùn)練位置面向池壁放入水池，記錄動(dòng)物的游行軌跡、找到平臺(tái)的時(shí)間（潛伏期）及錯(cuò)誤次數(shù)。在0、4、8、12周各進(jìn)行1次，由非操作實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)員分析潛伏期數(shù)據(jù)。
　　 5.血糖值所有大鼠在0、4、8、12周尾靜脈采血測量血糖值。
　　 6.HE染色切片脫蠟后，在蘇木素中染核3 min后1％鹽酸酒精分

5、化3s，返藍(lán)2 min，然后在伊紅中染胞質(zhì)2 min，流水沖2 min，梯度酒精脫水后封片。光學(xué)顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)。
　　 7.免疫組化實(shí)驗(yàn)切片脫蠟后行抗原修復(fù)、3％H2O2及5％山羊血清封閉、加一抗后4℃過夜。次日加二抗、辣根酶標(biāo)記、DAB顯色、蘇木素染核后梯度酒精脫水，封片。采用Kodak圖像分析系統(tǒng)及Image-ProPlus軟件測定其IOD值。
　　 8.RT-PCR實(shí)驗(yàn)按Trizol說明書提取海馬組織R

6、NA，用分光光度計(jì)測量RNA濃度，D260/280的值均應(yīng)在1.8～2.0之間。然后按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒中步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR嵌合熒光，以β-actin為內(nèi)參，HIF-1α為目的基因，Quantity one軟件測定HIF-1α/β-actin的相對(duì)表達(dá)量。使用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性。
　　 結(jié)果:
　　 1.一般狀態(tài)實(shí)驗(yàn)過程中糖尿病組大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿，體重增長緩慢，毛色

7、黯淡無光，嗜睡，尿液及糞便異臭味兒重等現(xiàn)象。中藥治療組大鼠體重逐漸增加，實(shí)驗(yàn)后期增重較快，飲食、進(jìn)水及尿量明顯少于糖尿病組大鼠，接近正常大鼠。正常對(duì)照組大鼠飲水進(jìn)食適中，體重隨周齡增長，活動(dòng)狀態(tài)正常。
　　 2.BAEP結(jié)果第4、8、12周糖尿病組較正常對(duì)照組、中藥治療組Ⅱ波PL延長(P＜0.05或P＜0.01)。第4、8、12周糖尿病組較正常對(duì)照組Ⅴ波PL延長(P＜0.01)，第8、12周，中藥治療組較糖尿病組Ⅴ波PL顯著縮短

8、(P＜0.05或P＜0.01)。第8、12周，糖尿病組較正常對(duì)照組、中藥治療組Ⅲ-ⅤIPL延長(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 3.水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果第4、8、12周，糖尿病組較正常對(duì)照組潛伏期延長(P＜0.05或P＜0.01);中藥治療組較糖尿病組潛伏期縮短(P＜0.05或P＜0.01)，較正常對(duì)照組延長(P＞0.05)。
　　 4.血糖值糖尿病組及中藥治療組大鼠12周內(nèi)持續(xù)高血糖。從第4周開始出現(xiàn)中藥治療組血糖值低

9、于糖尿病組，第8、12周，中藥治療組較糖尿病組血糖值顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 5.HE染色結(jié)果正常大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列有序、輪廓清晰、結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞漿淡染、顏色均勻，核仁清晰，核膜完整。糖尿病組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞層次差、排列混亂，正常形態(tài)的細(xì)胞中夾雜有大量異常細(xì)胞，這些異常細(xì)胞胞漿深染、胞體腫脹變形、核仁消失或體積增大。中藥治療組大鼠明顯好于糖尿病組，鏡下可見細(xì)胞排列較為整齊有序，形態(tài)和數(shù)量均接近正常，僅

10、有少量神經(jīng)細(xì)胞胞核深染或形態(tài)異常。
　　 6.免疫組化結(jié)果免疫組化圖片中棕黃色顆粒為HIF-1α表達(dá)陽性，使用IPP軟件測其IOD值，并比較各組HIF-1α表達(dá)情況。第4周中藥治療組和糖尿病組HIF-1α表達(dá)量高于正常對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)。第8、12周中藥治療組HIF-1α表達(dá)量較糖尿病組少(P＜0.05或P＜0.01)，較正常組高(P＞0.05);糖尿病組較正常組表達(dá)量高(P＜0.01)。
　　 7.R