丁苯酞對1型糖尿病大鼠認知功能及海馬MEK1表達的影響.pdf

1、目的:糖尿病認知功能障礙以學(xué)習(xí)記憶能力損害為主，最終導(dǎo)致癡呆，其發(fā)病機制尚未闡明，亦缺乏行之有效的防治手段。突觸是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)、神經(jīng)元之間信息傳遞的重要通道，突觸可塑性與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。MAPK/ERK通路在海馬突觸可塑性中起關(guān)鍵作用，該信號通路是高度保守的三級激酶級聯(lián)信號，即Ras/MEK/ERK，其中MEK1是ERK激活所需的高選擇性激酶，是該通路激活的重要中間環(huán)節(jié)。本研究重點觀察糖尿病大鼠發(fā)生認知障礙時海馬MEK1的

2、變化以及丁苯酞對糖尿病大鼠認知障礙的影響，有可能發(fā)現(xiàn)丁苯酞新的治療靶點，對糖尿病認知障礙的防治具有重要的理論與實際意義。
　　 方法:通過一次性腹腔注射大劑量鏈脲佐菌素(STZ，60mg.kg-1，i.p.)建立Ⅰ型糖尿病大鼠模型，并設(shè)立正常對照組。72h鼠尾靜脈取血測定血糖，≥16.7mmol/L為造模成功。隨后將糖尿病大鼠隨機分為糖尿病對照組，丁苯酞低劑量干預(yù)組(60mg.kg-1.d-1，i.g.)，丁苯酞高劑量干預(yù)組(1

3、20mg.kg-1.d-1，i.g.)。每周測大鼠體重及血糖，血糖＜16.7mmol/L則剔除。第12W行Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)測試，之后稱體重、測血糖，麻醉后處死大鼠，留取海馬組織。HE染色觀察海馬組織形態(tài)，免疫組織化學(xué)染色、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)與蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western-blot)檢測大鼠海馬組織中MEK1mRNA和p-MEK1蛋白的表達水平。
　　 結(jié)果:
　　 1、一般情況

4、>　　 正常對照組大鼠體重平穩(wěn)增長，精神狀況良好，毛色正常。而糖尿病大鼠則出現(xiàn)消瘦，精神萎靡，毛色枯黃無光澤，尿量、飲水量、進食量、明顯增多。
　　 2、血糖及體重變化
　　 注射STZ前，正常對照組與糖尿病模型組大鼠血糖均正常，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(7.19±0.92mmol/L比7.34±0.77mmol/LP＞0.05);兩組大鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(148.06±7.53g比149.28士4.29g，P＞0.05)

5、。注射STZ成模后6W末和12W末，相比正常對照組大鼠，糖尿病對照組、丁苯酞低劑量組和丁苯酞高劑量組血糖均顯著增高(P＜0.01），但體重明顯低于同期正常對照組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01）;而糖尿病對照組、丁苯酞低劑量組和丁苯酞高劑量組大鼠之間血糖相比及體重相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3、Morris水迷宮測試結(jié)果
　　 3.1、大鼠基礎(chǔ)游泳速度測試結(jié)果
　　 水迷宮測試前，在正常

6、對照組、糖尿病對照組、丁苯酞低劑量組和丁苯酞高劑量組中每組隨機抽取5只大鼠自由游泳60S，測定基礎(chǔ)游泳速度。結(jié)果顯示，4組大鼠之間游泳速度的差別不具有統(tǒng)計學(xué)意(28.23±1.64cm/s，29.79±2.34cm/s，30.10±3.19cm/s分別比30.77±2.60cm/s，P＞0.05)，所以本實驗不考慮大鼠個體游泳速度的因素。
　　 3.2、定位航行測試結(jié)果
　　 與正常對照組相比，糖尿病對照組、丁苯酞低劑量

7、組和丁苯酞高劑量組大鼠逃避潛伏期均明顯延長，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05），證明糖尿病大鼠出現(xiàn)了認知障礙;與糖尿病對照組相比，丁苯酞低劑量組和丁苯酞高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);丁苯酞低劑量組和丁苯酞高劑量組大鼠的逃避潛伏期在第1天和第2天無顯著差異，從第3天到第5天丁苯酞高劑量組大鼠的逃避潛伏期相比丁苯酞低劑量組明顯縮短，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）;連續(xù)5天的測試結(jié)果顯示，4個測試組大

8、鼠的逃避潛伏期均逐漸縮短，均為第1天＞第2天＞第3天＞第4天＞第5天，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 3.3、空間探索測試結(jié)果
　　 與正常對照組相比，糖尿病對照組、丁苯酞低劑量組和丁苯酞高劑量組大鼠穿越平臺的次數(shù)明顯減少(3.17±0.61，9.17±1.72，12.67±1.78分別比16.33±2.71，P＜0.05);與糖尿病對照組相比，丁苯酞低劑量組和丁苯酞高劑量組大鼠穿越平臺的次數(shù)顯著增加，差異有

9、統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）;與丁苯酞低劑量組相比，丁苯酞高劑量組大鼠穿越平臺次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 4、HE染色結(jié)果
　　 正常對照組大鼠海馬CA1區(qū)細胞排列整齊，神經(jīng)元核大而圓;糖尿病對照組大鼠海馬CA1區(qū)細胞排列紊亂，數(shù)目減少，細胞核著色加深，有些神經(jīng)元細胞出現(xiàn)質(zhì)、核界限不清，甚至空泡變性;丁苯酞干預(yù)組上述改變較糖尿病組明顯減輕，且120mg.kg-1丁苯酞干預(yù)組優(yōu)于60mg.kg-1

10、丁苯酞干預(yù)組。
　　 5、免疫組化染色結(jié)果
　　 與正常對照組相比，糖尿病對照組、丁苯酞低劑量組和丁苯酞高劑量組大鼠海馬組織中p-MEK1蛋白表達明顯減少（平均光密度值為0.14±0.00，0.25±0.02，0.34±0.02分別比0.41±0.02，P＜0.05）;與糖尿病對照組相比，丁苯酞低劑量組、丁苯酞高劑量組大鼠海馬組織中p-MEK1蛋白表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）;與丁苯酞低劑量組相比，丁苯

11、酞高劑量組大鼠海馬組織中p-MEK1蛋白表達量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 6、基因表達結(jié)果
　　 RT-PCR顯示:與正常對照組相比，糖尿病對照組、丁苯酞低劑量組和丁苯酞高劑量組大鼠海馬組織中MEK1mRNA表達量均明顯減少(0.16±0.00，0.25±0.00，0.33±0.01分別比0.40±0.01，P＜0.05);與糖尿病對照組相比，丁苯酞低劑量組和丁苯酞高劑量組大鼠海馬組織中MEK1m

12、RNA表達量均顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）;與丁苯酞低劑量組相比，丁苯酞高劑量組海馬組織中MEK1mRNA表達量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 7、蛋白表達結(jié)果
　　 Western-blot顯示:與正常對照組相比，糖尿病對照組、丁苯酞低劑量組和丁苯酞高劑量組大鼠海馬組織中p-MEK1蛋白表達量明顯減少(0.21±0.00，0.41±0.00，0.52±0.01分別比0.64±0.01，

13、P＜0.05);與糖尿病對照組相比，丁苯酞低劑量組、丁苯酞高劑量組大鼠海馬組織中p-MEK1蛋白表達量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）;與丁苯酞低劑量組相比，丁苯酞高劑量組大鼠海馬組織中p-MEK1蛋白表達量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、成模第12周糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，同時海馬組織中p-MEK1的表達減少。提示p-MEK1表達減少可能是糖尿病大鼠發(fā)生認知障礙的