丁苯酞對大鼠基因的影響研究.pdf

1、目的：丁苯酞為我國自主研發(fā)的國家Ⅰ類新藥，其具有改善局部腦缺血大鼠模型腦梗塞和記憶減退的作用，并能降低腦缺血性腦水腫，改善全腦缺血小鼠腦能量代謝的作用。但是口服的肝臟毒性作用點尚不了解。要鑒定丁苯酞早期肝臟癥狀難度較大，因為對丁苯酞肝臟作用的發(fā)生、發(fā)展表現形式了解不夠詳盡。臨床上作用的癥狀與肝功能下降程度不平行。由于對丁苯酞肝臟作用發(fā)生的作用點及分子機制知之甚少，故預防和藥物治療方向了解不夠，目前尚缺乏明確的治療措施。丁苯酞早期肝臟作用

2、研究目前處在個別分子基因水平終點上，而高通量、多終點基因芯片技術將為尋找暴露低于臨床中毒癥狀劑量的丁苯酞肝臟作用機制提供研究平臺。本實驗目的是觀察丁苯酞對大鼠口服10天以及停藥10天后肝臟的差異基因表達情況，為丁苯酞毒性分子機制研究及制定中毒治療方案提供科學依據。
　　 方法：⑴將丁苯肽以不同劑量給大鼠口服灌藥，作為實驗組，灌服自來水大鼠為對照組。灌藥后在不同時間點如，3天、10天、20天，10+10天將動物處死，取肝臟組織及其

3、它臟器-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。⑵按照一步法提取不同實驗組及對照組大鼠肝臟的RNA，參照Schena方法逆轉錄標記cDNA探針并純化。用Cy3-dCTP熒光標記對照組樣本，Cy5-dCTP熒光標記實驗組樣本，乙醇沉淀后將探針混合，溶于雜交液中。表達譜芯片由北京博奧生物芯片有限公司提供，芯片類型BiostarR-40s，大鼠芯片，該型芯片包含4094靶基因。⑶將預雜交的基因芯片和待雜交的探針分別在95℃水浴中變性30 s和2 min，將探針加

4、在芯片上，于雜交箱內42℃雜交過夜（15-18 hrs）。洗滌，晾干。⑷將雜交好的玻片浸入裝有洗滌液的染色缸中洗滌10 min，沖洗，晾干后掃描。⑸用掃描儀對芯片進行掃描，獲取基因表達的熒光信號強度值。用圖像處理軟件對雜交的芯片掃描圖像進行數字化處理，計算Cy3和Cy5兩種熒光信號的強度和比值，通過比值的范圍確定有差異表達的基因，并分析差異基因的種類。
　　 結果：①正常劑量（60mg/kg天）用藥3天，可見AY387051（1

5、1-β-羥類固醇脫氫酶），BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18）皆呈上調變化，其上調的幅度不大。而X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）沒有受到影響，未產生基因的變化。②正常劑量（60mg/kg·天）給藥10天，AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶）基因產生繼續(xù)上調，其上調的幅度大于正常劑量三天組，BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p4

6、50酶2家系a亞科多肽18）皆呈上調變化且上調幅度稍大與上組。X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）而沒有受到影響，未產生基因的變化。③正常劑量（60mg/kg·天）給藥20天，可見AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶），BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18），X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）皆產生上調的變化。AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶

7、）的上調幅度較前兩組皆幅度加大。④正常劑量（60mg/kg·天）服藥10天停藥10天，AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶）還是呈上調的變化。而BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18）皆恢復正常。證明10天停藥后該藥物對AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶）仍有持續(xù)影響，而對BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18）

8、的影響則消失。同時可見X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）呈下調變化。⑤高劑量（120mg/kg·天）給藥3天基因變化情況。所有四個基因AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶），BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18），X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）皆成上調變化。其上調幅度皆大于正常劑量三天組。證明了藥物劑量的增加對于這幾個基因的影響作用亦增加。⑥高劑

9、量（120mg/kg·天）給藥10天基因變化情況。AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶），BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18）皆繼續(xù)呈上調，而X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）恢復正常。與一倍劑量組相比，Y387051（11-β-羥類固醇脫氫酶），BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18）的上調程度有所增加

10、。⑦高劑量（120mg/kg·天）給藥20天基因變化情況。AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶），BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18），X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）皆呈上調變化。其中X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）的上調幅度較正常劑量20天時明顯增加。⑧高劑量（120mg/kg·天）給藥10天停藥10天的基因變化情況。AY387051（11

11、-β-羥類固醇脫氫酶）繼續(xù)成上調變化。而其他三個基因BC089765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18），X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）則恢復正常?？梢妼τ贏Y387051（11-β-羥類固醇脫氫酶）藥物的影響較其他三個基因持續(xù)，且不易恢復。⑨四倍劑量組（240mg/kg·天）給藥3天基因變化情況。所有四個基因AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶），BC089765（p4

12、50酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18）， X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）皆產生上調的變化。而其中X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）的上調幅度很大。與前給藥相比，高劑量初始對于X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）的影響大于對于其他三個基因。⑩四倍劑量組（240mg/kg·天）給藥10天基因變化情況。所有四個基因AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶），BC089

13、765（p450酶2家系a亞科多肽2），x79991（p450酶2家系a亞科多肽18），X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）皆產生上調的變化。其中AY387051（11-β-羥類固醇脫氫酶）的上調幅度明顯加大，而X63545（p450酶2家系b亞科多肽12）上調幅度有所降低。
　　 結論：丁苯肽大鼠灌胃研究大鼠肝內4094個基因變化，其中一些基因m RNA發(fā)生變化，不同劑量丁苯肽作用下基因mRNA發(fā)生變化也不同。其中有