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文檔簡介
1、目的:肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是神經(jīng)系統(tǒng)慢性進行性變性疾病,選擇性累及腦和脊髓中的運動神經(jīng)元。臨床表現(xiàn)為逐漸加重的肌無力、肌萎縮及錐體束征,最終累及呼吸肌,多于發(fā)病后3-5年內死亡。其具體發(fā)病機制尚不明確,一般認為與谷氨酸毒性,氧化應激,細胞骨架異常,軸漿運輸障礙等多種病因相關。目前,除利魯唑可延緩其疾病進展外,缺乏有效治療。
氧化應激被認為是多種神經(jīng)退行性疾病的
2、最后通路,其作為ALS發(fā)病機制之一也愈發(fā)受到關注。中樞神經(jīng)系統(tǒng)對活性氧敏感的原因:
1)神經(jīng)元內天然抗氧化劑谷胱甘肽含量低;
2)細胞膜含有較高成分的不飽和脂肪酸;
3)腦的高代謝使得需氧量相對增多。
鐵是人體必須微量元素,具有多種生理功能,但是過多的鐵離子聚集會通過Fenton反應生產(chǎn)羥自由基,導致氧化應激,造成DNA,脂質,蛋白質的損傷。鐵穩(wěn)態(tài)的平衡有賴于多種鐵代謝相關蛋白,而
3、鐵蛋白(Ferritin)作為鐵代謝相關蛋白之一則發(fā)揮著重要的調節(jié)作用,其可以結合游離的二價鐵離子,阻止Fenton反應及后續(xù)的氧化應激的發(fā)生,從而起到腦保護的作用。研究證實肌萎縮側索硬化患者體內鐵代謝異常,血清鐵蛋白升高,而且,動物模型中也證實鐵離子螯合劑可以阻止SOD1G93A轉基因鼠運動神經(jīng)元變性,延緩疾病進展并延長壽命。
丁苯酞(dl-3-n-Butylphthalide)是我國心腦血管領域中第一個擁有自主知識產(chǎn)權
4、的新藥,提取于芹菜種子中,相對分子質量為190.24,具有多種神經(jīng)保護功能,可直接通過血—腦屏障,重構缺血區(qū)微循環(huán),保護線粒體免受損傷,改善能量代謝等。研究證實其可以明顯改善血管性癡呆患者的癥狀,提高其血清內SOD的活性并降低MDA的含量,從而減少氧化應激。
在以往的研究中,我們發(fā)現(xiàn)丁苯酞可以延長SOD1G93A轉基因模型鼠的壽命,本實驗通過觀察丁苯酞對家族性肌萎縮側索硬化轉基因模型鼠SOD1G93A的發(fā)病時間和生存期及其
5、脊髓Ferritin表達的影響,旨在探討丁苯酞對SOD1G93A轉基因鼠的作用及其神經(jīng)保護機制。
方法:
1、動物分組及藥物干預
經(jīng)PCR技術鑒定,選取SOD1G93A陽性小鼠72只,隨機分為丁苯酞組(發(fā)病早期及終末期),安慰劑組(發(fā)病早期及終末期),空白對照組(發(fā)病早期及終末期),每組12只,雌雄各半。于42天起應用180mg/kg劑量的丁苯酞干預治療組,安慰劑組則給予10ml/kg的玉米油,
6、采用灌胃方法,一天一次,空白對照組自由攝取自來水。分別于發(fā)病早期(110天左右)及終末期取材。
2、發(fā)病時間及生存期判定
若SOD1G93A轉基因鼠出現(xiàn)后肢癱瘓或走路不穩(wěn)的跡象則判定為發(fā)病[2],小鼠從出生到發(fā)病的時間記錄為發(fā)病時間;將其仰臥位放置于平板上不能翻身,或體重丟失20%,視為終末期[2],小鼠從出生到死亡的時間記錄為生存期。
3、免疫組化
采用10%水合氯醛麻醉小鼠后,
7、以4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定20~30分鐘后,取小鼠腰段脊髓固定于多聚甲醛內48小時,震蕩切片25μm厚度,應用免疫組織化學方法觀察腰段脊髓Ferritin的表達情況,其中符合位于脊髓中央管以前、胞核及核仁著色清晰,直徑大于25μm的運動神經(jīng)元定為α運動神經(jīng)元。
4、免疫印跡
采用10%水合氯醛麻醉小鼠后,即刻新鮮取材,取小鼠腰段脊髓,液氮冷凍,-80℃保存,采用免疫印跡的方法觀察腰段脊髓總蛋白中Ferrit
8、in的定量表達。
5、統(tǒng)計學方法
所有數(shù)據(jù)應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理,生存時間采用Kapane-Meier(K-M)生存曲線進行統(tǒng)計分析,計量資料應用(X)±S表示,生化指標應用ANOVA進行方差分析。P<0.05有統(tǒng)計學意義。
結果:
1、發(fā)病時間與生存期
發(fā)病時間:丁苯酞組為118.0±2.5,安慰劑組為109.5±2.2,空白對照組為107.1±1.
9、0;丁苯酞組與安慰劑組相比較,P=0.011,<0.05,具有統(tǒng)計學差異;丁苯酞組和空白對照組相比,P=0.000,<0.05,具有統(tǒng)計學差異;而安慰劑組和空白對照組相比,P=0.209,>0.05,無明顯統(tǒng)計學差異。
生存時間:丁苯酞組為138.6±2.3,安慰劑組為128.1±2.8,空白對照組為127.4±2.3;丁苯酞組與安慰劑組相比較,P=0.034,<0.05,具有統(tǒng)計學差異;丁苯酞組和空白對照組相比,P=0.
10、000,<0.05,具有統(tǒng)計學差異;而安慰劑組和空白對照組相比,P=0.555,>0.05,無明顯統(tǒng)計學差異。
2、免疫組化
發(fā)病初期,F(xiàn)erritin蛋白陽性的神經(jīng)元數(shù)目,丁苯酞組為23.83±1.75;安慰劑組為17.67±3.39;空白對照組為13.50±1.73;各組間相比較,P=0.000,<0.05,具有統(tǒng)計學差異;安慰劑組和空白對照組中的運動神經(jīng)內胞漿和胞膜周圍均勻著色,而丁苯酞組中的運動神經(jīng)元
11、內僅胞膜周圍著色,胞核和胞漿著色不明顯。
終末期,F(xiàn)erritin蛋白陽性的神經(jīng)元數(shù)目,丁苯酞組為8.25±1.22;安慰劑組為5.33±0.78;空白對照組為4.67±1.16;各組間相比較,P=0.000,<0.05,具有統(tǒng)計學差異;安慰劑組及空白對照組中的運動神經(jīng)元數(shù)目較丁苯酞組相比減少,三者胞核及胞漿均有著色,并且可見膠質細胞增生。
3、免疫印跡
發(fā)病初期,F(xiàn)erritin在腰髓表達量的
12、相對值,丁苯酞組為0.81±0.23;安慰劑組為1.57±0.43;陰性對照組為0.35±0.13;三者相比較,P=0.006,<0.05,具有統(tǒng)計學差異;丁苯酞組與安慰劑組相比較,P=0.039,<0.05,具有統(tǒng)計學差異;丁苯酞組與陰性對照組相比較,P=0.042,<0.05,具有統(tǒng)計學差異;安慰劑組與陰性對照組相比較,P=0.006,<0.05,具有統(tǒng)計學差異。
終末期,F(xiàn)erritin在腰髓表達量的相對值,丁苯酞組
13、為1.45±0.45;安慰劑組為1.73±0.36;陰性對照組為0.78±0.36;三者相比較,P=0.023,<0.05,具有統(tǒng)計學差異;丁苯酞組與安慰劑組相比較,P=0.449,>0.05,無統(tǒng)計學差異;丁苯酞組與陰性對照組相比較,P=0.047,<0.05,具有統(tǒng)計學差異;安慰劑組與陰性對照組相比較,P=0.010,<0.05,具有統(tǒng)計學差異。
結論:丁苯酞可以減少脊髓Ferritin的表達,延遲ALS小鼠的發(fā)病時間
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