丁苯酞對實(shí)驗性自向免疫性腦脊髓炎小鼠Na+-K+ATPase、ERK1-2表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的慢性炎癥性脫髓鞘疾病，以髓鞘脫失、軸索病變、炎性細(xì)胞浸潤、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生和進(jìn)行性神經(jīng)功能障礙為主要特點(diǎn)，好發(fā)于青年人，目前尚缺乏有效的治療方法，致殘率高。丁苯酞(dl-3n-butlphalide，NBP)是我國腦血管疾病治療領(lǐng)域中第一個擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的國家級一類新藥，是首個在國際上通過作用于多個靶點(diǎn)及多個環(huán)節(jié)來治療缺血性腦卒中的一種創(chuàng)

2、新藥物。臨床藥效學(xué)研究表明，丁苯酞具有保護(hù)線粒體功能和增加缺血區(qū)灌注的作用，可阻斷缺血性腦卒中所致腦損傷的多個病理環(huán)節(jié)，具有較強(qiáng)的抗腦缺血作用，可明顯減小梗死面積，減輕梗死后腦水腫，改善神經(jīng)功能缺損，起到腦組織保護(hù)作用。基于丁苯酞的對缺血性腦病的研究基礎(chǔ)，我們推測丁苯酞是否可通過保護(hù)線粒體而對多發(fā)性硬化起到一定的預(yù)防和治療作用？但目前尚未見關(guān)于該方面的研究及報道。故本課題擬采用人類多發(fā)性硬化的經(jīng)典模型-實(shí)驗性自身免疫性腦脊髓炎(expe

3、rimentalautoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠作為研究對象，通過腹腔注射不同劑量丁苯酞注射液進(jìn)行藥物干預(yù)，動態(tài)觀察EAE小鼠不同發(fā)病階段中臨床病情及脊髓組織中線粒體Na+/K+ATP酶及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)表達(dá)水平的變化，探討丁苯酞是否對EAE有治療作用及可能的機(jī)制，為臨床多發(fā)性硬化的治療提供新的思路和方法，同時為擴(kuò)展丁苯酞的臨床應(yīng)用范圍提供更多的實(shí)驗依據(jù)。
　　方法:<

4、br>　　以完全弗氏佐劑+小劑量MOG35-55為抗原乳劑免疫誘導(dǎo)C57BL/6小鼠來制作EAE模型。EAE模型制作成功后將發(fā)病小鼠隨機(jī)分為4組，即EAE組、丁苯酞低劑量干預(yù)組(NBP-L組)、丁苯酞高劑量干預(yù)組(NBP-H組)及地塞米松組（D組），并于發(fā)病當(dāng)天（0天）開始進(jìn)行藥物干預(yù)，丁苯酞各組分別給NBP-L組小鼠腹腔注射丁苯酞80mg/kg/天、NBP-H組小鼠腹腔注射丁苯酞120mg/kg/天、D組小鼠腹腔注射地塞米松磷酸鈉0.

5、07mg/kg/天，3組均連續(xù)注射14天，EAE組不做特殊干預(yù)，同時取正常小鼠9只設(shè)為正常對照組（N組）。觀察各組小鼠的發(fā)病情況、體重變化和神經(jīng)功能障礙情況，并采用國際通用的Benson（5分）評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分。于發(fā)病當(dāng)天(0d)，藥物干預(yù)后第7天(7d)、第14天(14d)處死小鼠并取脊髓腰膨大部位組織后，以實(shí)時定量PCR(RT-PCR)方法觀察小鼠脊髓腰膨大組織ERK1/2 mRNA及Na+/K+ATPase mRNA表達(dá)情

6、況;以免疫組化法觀察Na+/K+ATPase的表達(dá)情況。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理各組數(shù)據(jù)，各組計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組比較應(yīng)用單因素方差分析，計數(shù)資料組間比較用卡方檢驗;兩組間比較用Student's t-檢驗，均以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、各組小鼠臨床癥狀觀察:發(fā)病后第7天，NBP-L組、NBP-H組、D組小鼠的神經(jīng)功能評分均顯著小于同時期EAE組小鼠(P＜0.05);NB

7、P-L組、NBP-H組、D組間比較，小鼠神經(jīng)功能評分無明顯差異（P＞0.05）。發(fā)病后第14天，NBP-L組、NBP-H組、D組小鼠的神經(jīng)功能評分均顯著小于EAE組小鼠，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);NBP-L組、NBP-H組、D組間比較，小鼠神經(jīng)功能評分無明顯差異(P＞0.05)。
　　2、EAE組小鼠第0、7、14天的神經(jīng)功能評分與脊髓組織的ERK1/2表達(dá)水平相關(guān)性分析結(jié)果:r=-0.9914，v=1，查t界值表得0.025

8、＜p＜0.05。按a=0.05的水準(zhǔn)，EAE組小鼠的神經(jīng)功能評分與其脊髓組織的ERK1/2的表達(dá)水平之間有負(fù)的直線相關(guān)關(guān)系。
　　3、實(shí)驗各組小鼠脊髓組織于0天、7天、14天時ERK1/2的表達(dá)水平比較:0天即EAE模型小鼠發(fā)病當(dāng)天時，其脊髓ERK1/2 mRNA的表達(dá)水平顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。發(fā)病及藥物干預(yù)后第7天，EAE7組較EAE0組比較，ERK1/2表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05）;NBP

9、-H7組與EAE7組比較，其ERK1/2 mRNA表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);NBP-L7組、D7組分別與EAE7組比較，ERK1/2 mRNA表達(dá)水平均無明顯變化(P＞0.05)。發(fā)病及藥物干預(yù)后第14天，EAE14組小鼠脊髓ERK1/2 mRNA表達(dá)水平均明顯低于EAE7組和EAE0組(P＜0.05);NBP-H14組、D14組分別與EAE14組比較，其ERK1/2 mRNA表達(dá)水平均明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意

10、義（P＜0.05）;NBP-H14組小鼠脊髓ERK1/2 mRNA表達(dá)水平又明顯高于 D14組（P＜0.05）。
　　4、各組小鼠脊髓線粒體Na+/K+ATPase免疫組化結(jié)果比較:EAE組、NBP組及D組各亞組Na+/K+ATPase陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)均低于正常對照組(P＜0.05)，但NBP組及D組各亞組Na+/K+ATPase陽性細(xì)胞數(shù)均高于同期EAE各組(P＜0.05)，D組各組又均高于同期NBP各組(P＜0.05)，NBP1

11、4天組表達(dá)高于NBP7天組（P＜0.05），但NBP各組不同劑量間Na+/K+ATPase表達(dá)未見明顯差異(P＞0.05)。
　　5、小鼠脊髓組織中Na+/K+ATPase mRNA表達(dá)情況(real-time PCR):EAE0、EAE7、EAE14、NBP-L7、NBP-H7、NBP-L14、NBP-H14及D14小鼠脊髓Na+/K+ATPase表達(dá)水平均低于正常對照組(P＜0.05)，NBP-L14及NBP-H14組均高于E

12、AE7、EAE14組(P＜0.05)，DXM14天組表達(dá)高于EAE14天組(P＜0.05)，NBP-L7與NBP-H7組間表達(dá)無明顯差異（P＞0.05），NBP-L14與NBP-H14組間表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、EAE發(fā)病過程中伴隨著線粒體的損傷，Na+/K+ATP酶的含量的降低;丁苯酞有減輕線粒體損傷的作用。
　　2、EAE的病情嚴(yán)重程度與ERK1/2的表達(dá)水平存在著負(fù)性直線相關(guān)關(guān)系。<