FGF-2對(duì)SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)病機(jī)制作用的研究.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種致命性的神經(jīng)退行性疾病。它是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(MND)中最常見(jiàn)的類型，特點(diǎn)為上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元同時(shí)受累，主要累及脊髓前角細(xì)胞、小腦運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元等并導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞變性死亡[1]。主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的骨骼肌無(wú)力與萎縮等，60％以上患者在起病3年內(nèi)死亡，約有10％生存期可達(dá)8年以上[2]。ALS中約有5-10％為家族性ALS(famili

2、al ALS，fALS)[3]，其余患者為散發(fā)性ALS(sporadic ALS，sALS)，無(wú)家族史。其中大約有fALS中的10-20％和sALS中的4％都和銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Znsuperoxide dismutase1，SOD1)的突變有關(guān)[4，5]。ALS的發(fā)病機(jī)制到目前為止還尚未完全明確，在過(guò)去的相關(guān)研究中研究人員根據(jù)各方面的研究成果提出了很多種假說(shuō)，包括谷氨酸興奮毒性、氧化應(yīng)激、蛋白的異常折疊和聚集、線粒體損傷、自身

3、免疫機(jī)制以及營(yíng)養(yǎng)因子缺乏等[6，7]。
　　成纖維生長(zhǎng)因子2(Fibroblast growth factor2，F(xiàn)GF-2)是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，是成纖維生長(zhǎng)因子的一種，它在細(xì)胞的復(fù)制、分化等起到調(diào)節(jié)作用[8,9]，在神經(jīng)系統(tǒng)中具有廣泛的作用，表達(dá)于多種細(xì)胞類型，包括神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等[8，10]。FGF-2在大腦損傷后和多種神經(jīng)細(xì)胞中受調(diào)控的神經(jīng)保護(hù)作用中出現(xiàn)上調(diào)[9]。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲除FGF-2的SOD1G93A小鼠

4、的可觀察到發(fā)病推遲、生存期延長(zhǎng)、癥狀相對(duì)較輕等[11]。
　　本研究在此基礎(chǔ)上利用ALS轉(zhuǎn)基因模型，即SOD1G93A小鼠，來(lái)研究SOD1G93A小鼠癥狀早起及癥狀終末期大腦皮層、小腦、腰段脊髓以及肌肉組織中FGF-2的表達(dá)差異，進(jìn)行western bloting和熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表達(dá)譜結(jié)果，探索ALS疾病中各個(gè)組織中FGF-2的表達(dá)變化，探討其在該病的發(fā)生發(fā)展中起到的作用及意義。
　　方法:
　　1、轉(zhuǎn)基因鼠的

5、繁殖
　　所有本實(shí)驗(yàn)中使用到的小鼠全都在恆溫、恆濕、無(wú)特定病原菌(specificpathogen free，SPF)的環(huán)境中飼養(yǎng)，使用SPF級(jí)顆粒型鼠類飼料和無(wú)菌水喂養(yǎng)。為了B6 SJL.TgN(SOD1G93A)1Gur轉(zhuǎn)基因小鼠突變基因穩(wěn)定下傳的維持，使用B6SJLSOD1G93A/+雜合子雄鼠與B6SJLF1/J雜合子雌鼠進(jìn)行交配繁殖，這兩種小鼠均購(gòu)買于美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor, ME，USA)。密切

6、觀察小鼠，并于小鼠3-4周時(shí)剪取子代鼠尾尖部組織進(jìn)行基因鑒定，以明確其是否攜帶有人突變SOD1(hSOD1)基因。
　　2、實(shí)驗(yàn)分組
　　實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和同窩對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組為隨機(jī)選取不同時(shí)期的SOD1G93A雌性轉(zhuǎn)基因小鼠，同窩對(duì)照組分別為雌性非轉(zhuǎn)基因同窩小鼠。取癥狀終末期各組小鼠各3只用于進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，取30天、60天、90天及癥狀終末期各組小鼠各3只用于進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。
　　3、試驗(yàn)方法
　　3.

7、1取材
　　各個(gè)時(shí)期的各組小鼠用百分之十的水合氯醛進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉后，分別以4％多聚甲醛灌流固定保存或新鮮取大腦皮層、小腦、腦髓和肌肉組織并迅速投入液氮速凍后于.80℃冰箱保存。其中用于western blot實(shí)驗(yàn)的小鼠進(jìn)行新鮮取材。用于RT-PCR的小鼠進(jìn)行固定保存。
　　3.2免疫印跡(Western blotting)
　　分別提取大腦皮層、小腦、腰髓以及后腿肌肉總蛋白，用BCA法測(cè)蛋白濃度。使用10％或12％

8、SDS，進(jìn)行PAGE電泳后，使用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，使用PBS稀釋過(guò)的5％的脫脂奶粉室溫封閉1小時(shí)，再分別加入鼠抗GAPDH抗體(1∶500)和兔抗FGF2抗體(1∶500)。4℃環(huán)境搖床中過(guò)夜。第二天，先使用TPBS洗3次，每次持續(xù)5分鐘左右。再分別加入抗鼠和抗兔熒光二抗(1∶10000)室溫孵育1小時(shí)，然后用TPBS洗3次，PBS洗1次，每次5分鐘。再用Odyssey紅外掃描儀（美國(guó)LI.COR公司）掃膜并且分析其結(jié)果。最后，計(jì)算需

9、要的目的條帶和GAPDH灰度的比值并且再進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　3.3熒光定量PCR
　　進(jìn)行小鼠脊髓腰段的新鮮取材，迅速置于液氮中，于-80℃冰箱中保存。提取樣本的RNA并且進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，再使用Stratagene Mx3005P熒光定量PCR儀擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)所需的目的基因。
　　3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　計(jì)量資料用x±s表示，采用SPSS13.O軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，統(tǒng)計(jì)方法為成組數(shù)據(jù)的t檢驗(yàn)，各時(shí)期間比較采用Stu

10、dent-Newman-Keuls檢測(cè)。采用檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05，P＜0.05為有差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定
　　子代小鼠基因鑒定結(jié)果:對(duì)待檢小鼠基因組PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，內(nèi)參照IL.2的條帶(324 bp)位于300.400bp之間;突變SOD1基因的條帶(236bp)位于200.300bp之間。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化測(cè)序，以確定其片段大小為236bp，證實(shí)其為hSOD1基因目的條帶，存在

11、G93A位點(diǎn)(GCT替代GGT)突變。
　　2、目的蛋白的表達(dá)
　　轉(zhuǎn)基因小鼠中陽(yáng)性小鼠較對(duì)照組陰性小鼠肌肉組織中FGF-2的含量增加(P＜0.05），其他部位含量沒(méi)有顯著變化。
　　3、RT-PCR結(jié)果
　　我們檢測(cè)了不同時(shí)期轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層、小腦、腰段脊髓及肌肉中FGF2 mRNA的表達(dá)。與同窩對(duì)照相比，SOD1 G93A轉(zhuǎn)基因小鼠在30天，60天，120天以及癥狀終末期脊髓中FGF-2基因表達(dá)均無(wú)明顯變化