PR(+)-PR(-)乳腺癌差異表達(dá)MicroRNAs潛在作用通路的生物信息學(xué)分析及初步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.pdf

1、研究背景：
　　 乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的主要惡性腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率有增高趨勢(shì)。中國(guó)乳腺癌發(fā)病率較低，但卻以年均3-4％的速度上升，遠(yuǎn)高于全球年均0.5％的上升速度。事實(shí)上，乳腺癌是一類分子水平上高度異質(zhì)性的疾病，根據(jù)不同的分子特征（ER、PR、HER-2狀態(tài)等）可將乳腺癌分成大致由4至5個(gè)亞群，即Luminal亞型(ER/PR+)、HER-2+(ER-,PR-,HER-2+)、Basal-like(ER-,PR-,HER

2、-2-)和Normal-like等，而ER/PR+又分成LuminalA(HER-2-)和LuminalB(HER-2+)。Luminal、HER-2+和Basal-like分別占65％～70％、10％和10％～15％。它們?cè)谂R床治療反應(yīng)和生存方面截然不同。尤其是內(nèi)分泌治療，是乳腺癌輔助治療的重要組成部分，與乳腺癌細(xì)胞的激素受體狀態(tài)密切相關(guān)，ER與PR均陽(yáng)性者有效率為60％～70％，ER或PR陽(yáng)性有效率為30％～40％，兩者均陰性有效率

3、小于10％。因此內(nèi)分泌治療在乳腺癌治療中的地位越來(lái)越受到人們的重視。其中PR是決定乳腺癌分子分型、預(yù)測(cè)預(yù)后和指導(dǎo)內(nèi)分泌治療的重要分子標(biāo)志。然而，不同患者產(chǎn)生不同分子與病理類型乳腺癌的機(jī)理目前尚未明確，深入探討乳腺癌不同分子分型可能存在的分子機(jī)制，對(duì)于臨床上乳腺癌早期判斷、及時(shí)診治、判斷內(nèi)分泌治療的療效具有重要意義。
　　 成熟microRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)約22nt的內(nèi)源性的非編碼的單鏈微小RNA分子，能夠特異靶向信

4、使RNA(mRNA)并通過(guò)對(duì)mRNA剪切或轉(zhuǎn)錄后抑制的機(jī)制發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能。通過(guò)與靶基因3'UTR完全或者不完全的匹配，miRNA可以降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因mRNA的翻譯.眾多研究表明，當(dāng)改變miRNA的表達(dá)水平時(shí)，它的很多靶基因的表達(dá)也會(huì)呈現(xiàn)出明顯變化。目前普遍認(rèn)為microRNAs參與的基因調(diào)控是遺傳程序中最基本的一步，調(diào)控著細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、凋亡、代謝等功能，它的異常表達(dá)與腫瘤相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有密切聯(lián)系。MicroR

5、NA表達(dá)譜分析顯示，在乳腺癌組織和正常組織之間，以及不同類型乳腺癌組織之間都存在特異性的microRNA標(biāo)記。近年的研究表明，在乳腺癌中不同狀態(tài)孕激素受體(PR)之間亦存在差異表達(dá)microRNAs，提示microRNAs可能參與PR(+)/PR(-)形成的調(diào)控過(guò)程。
　　 二、研究目的
　　 1.了解目前乳腺癌內(nèi)分泌治療相關(guān)基因的研究現(xiàn)狀，以明確進(jìn)一步研究與內(nèi)分泌密切相關(guān)的分子分型的必要性。
　　 2.對(duì)PR(

6、-)/PR(+)乳腺癌microRNAs差異表達(dá)譜進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探討microRNAs在PR表達(dá)狀態(tài)中可能參與的調(diào)控機(jī)制，為深入研究乳腺癌不同分子亞型的分化提供新思路。
　　 3.根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)所得結(jié)果，構(gòu)建miRNA與靶基因的熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行初步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究乳腺癌的分子分型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 三、實(shí)驗(yàn)方法
　　 第一部分
　　 1.1文獻(xiàn)檢索
　　 選取Embas

7、e數(shù)據(jù)庫(kù)、Medline/Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)為檢索數(shù)據(jù)庫(kù)。Embase數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Emtree擴(kuò)展檢索，輔以自由詞的題目及摘要字段的檢索;Pubmed/Medline數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行MeSH檢索，輔以自由詞的題目及摘要字段的檢索。
　　 1.2文獻(xiàn)計(jì)量分析
　　 采用Endnote X3軟件對(duì)所檢索文獻(xiàn)管理，在此軟件平臺(tái)上完成文獻(xiàn)納入排除工作。用文獻(xiàn)列表轉(zhuǎn)換器將Endnote X3中的標(biāo)注信息導(dǎo)出，對(duì)最終符合納入標(biāo)準(zhǔn)的每篇文獻(xiàn)分

8、別進(jìn)行出版年、國(guó)家、期刊、研究機(jī)構(gòu)、作者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
　　 第二部分
　　 2.1數(shù)據(jù)挖掘:在數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“microRNAs”和“breast cancer”為任意詞進(jìn)行檢索，納入標(biāo)準(zhǔn)為“人類”及“臨床樣本”。對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行人工分析，篩選出相關(guān)文獻(xiàn)及差異表達(dá)miRNAs集。
　　 2.2靶基因的預(yù)測(cè)及去重:利用Targetscan軟件對(duì)各篇文獻(xiàn)中挖掘所得的差異表達(dá)miRNAs集及各個(gè)miRNAs集的合集進(jìn)行預(yù)測(cè)，

9、得到多個(gè)靶基因集及靶基因合集。再利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中的“Gene ID Conversion”功能模塊對(duì)靶基因集去除重復(fù)基因。
　　 2.3靶基因集的兩步富集:(Step1)以整個(gè)人類基因組為背景對(duì)照，利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中“Functional Annotation Chart”功能模塊下的“tissue_expression”工具對(duì)靶基因集中乳腺組織特異性表達(dá)的基因進(jìn)行組織富集。(Step2)同樣以人類基因組為背景對(duì)照，再

10、利用“Functional Annotation Chart”功能模塊下的基因本體論(GeneOntology，GO)生物學(xué)過(guò)程(biological processes，BP)分類對(duì)經(jīng)過(guò)組織特異性表達(dá)富集后的靶基因集進(jìn)行GO BP分類富集，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性臨界值取P≤0.05。
　　 2.4靶基因集的功能及通路分析:利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中“Functional AnnotationChart”功能模塊下的“GOTERM_ BP_

11、FA”和“GOTERM_MF_FAT”功能對(duì)經(jīng)過(guò)兩步富集分析后的靶基因集分別進(jìn)行GO生物學(xué)過(guò)程(BP)、GO分子功能(molecularfunction，MF)分析，再利用“KEGG_Pathways”和“BIOCARTA”分析功能進(jìn)行信號(hào)和通路分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性臨界值取P≤0.05。
　　 第三部分
　　 3.1靶向CARM1基因的miRNAs預(yù)測(cè)與篩選:根據(jù)第二部分生物信息學(xué)的結(jié)果，我們選擇CARM1為研究對(duì)象，通過(guò)

12、Pictar、Miranda、TargetScan初步預(yù)測(cè)作用于CARM1的所有microRNA，然后再對(duì)比第一部分中PR(+)/PR（-）乳腺癌差異表達(dá)microRNA表達(dá)譜中的miRNA，判斷預(yù)測(cè)可能作用于CARM1的microRNA，再以篩選出的miRNA與CARM1為研究對(duì)象進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　 3.2攜目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建:設(shè)計(jì)并人工合成針對(duì)microRNA的CARM1目的基因片段并定向克隆到psiCHECK-

13、2載體上，采用雙酶切凝膠電泳與基因測(cè)序法鑒定重組載體psi-CHECK-2-CARM1-9與psi-CHECK-2-CARM1-103。
　　 3.3雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的構(gòu)建:將該重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞后用雙熒光報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行熒光檢測(cè)以確定miRNA與CARM1基因的靶向關(guān)系。
　　 四、結(jié)果
　　 4.1第一部分
　　 乳腺癌內(nèi)分泌治療相關(guān)基因的研究正處于一個(gè)快速發(fā)展的階段。美國(guó)是該領(lǐng)域相

14、關(guān)研究最為活躍的國(guó)家。關(guān)注這一主題的文獻(xiàn)逐漸增多，其中尤以BreastCancer Research and Treatmen與Clinical Cancer Research期刊載文量為多。
　　 4.2第二部分
　　 通過(guò)文獻(xiàn)挖掘找到3個(gè)差異表達(dá)microRNA數(shù)據(jù)集，生物信息學(xué)分析獲得3個(gè)相應(yīng)靶基因集和1個(gè)靶基因合集。靶基因的GO分類主要涉及細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)、蛋白氨基酸磷酸化、蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶活性及轉(zhuǎn)錄因子活性等生

15、物學(xué)過(guò)程及分子功能。通路分析發(fā)現(xiàn)3條KEGG信號(hào)通路和3條BIOCARTA代謝通路可能參與不同PR表達(dá)狀態(tài)的調(diào)節(jié)。其中關(guān)鍵基因CARM1引起我們的注意。
　　 4.3第三部分
　　 雙酶切凝膠電泳和基因測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒psi-CHECK-2-CARM1-9、psi-CHECK-2-CARM1-103得到的產(chǎn)物片段及測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致。分別共轉(zhuǎn)染miR-9 minics與重組質(zhì)粒 psi-CHECK-2-CARM1-9、m

16、iR-103與psi-CHECK-CARM1-103至 HeLa細(xì)胞中，其中 miR-103與psi-CHECK-CARM1-103組的熒光素酶活性顯著降低(P＜0.01)，比對(duì)照組（共轉(zhuǎn)染miRNA minics與重組質(zhì)粒control的HeLa細(xì)胞組）減弱了42.54％;
　　 五、結(jié)論
　　 1、乳腺癌內(nèi)分泌治療的研究越來(lái)越受到重視，但有關(guān)分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。
　　 2、從生物信息學(xué)的角度初步分析了m