口腔鱗狀細(xì)胞癌差異基因的篩選驗(yàn)證及相互作用的生物信息學(xué)分析.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分口腔鱗狀細(xì)胞癌的基因表達(dá)譜芯片檢測
　　目的:本實(shí)驗(yàn)通過基因表達(dá)譜芯片檢測口腔鱗狀細(xì)胞癌組織與癌旁正常對(duì)照組織的基因表達(dá)譜，從基因表達(dá)譜結(jié)果中篩選出變化明顯的差異基因。
　　方法:在廣東省口腔醫(yī)院收集口腔鱗狀細(xì)胞癌患者兩例，每例患者采集口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁正常對(duì)照組織作為一組，采用Roche NimbleGen全基因組表達(dá)譜芯片進(jìn)行口腔鱗狀細(xì)胞癌及癌旁正常對(duì)照組織的基因

2、表達(dá)譜檢測。
　　結(jié)果:按差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)，從32448條檢測基因中篩選出口腔鱗狀細(xì)胞癌腫瘤組織的差異基因共有7872條，占篩選基因總數(shù)的24％;其中上調(diào)表達(dá)的基因有3800條，下調(diào)表達(dá)的有4072條。
　　結(jié)論:通過基因表達(dá)譜芯片檢測并根據(jù)表達(dá)差異一倍以上的篩選標(biāo)準(zhǔn)得到了7872個(gè)表達(dá)差異的基因。由此可見腫瘤的發(fā)生發(fā)展不是單個(gè)或幾個(gè)基因的作用結(jié)果，以往實(shí)驗(yàn)往往針對(duì)某個(gè)或某幾個(gè)基因的研究有很大的局限性。同時(shí)也說明了腫瘤的產(chǎn)生

3、是多基因成網(wǎng)絡(luò)相互調(diào)節(jié)作用的結(jié)果，而且這個(gè)網(wǎng)絡(luò)的作用關(guān)系是非常復(fù)雜的。
　　第二部分基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析
　　目的:我們通過基因表達(dá)譜芯片檢測比較了口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁正常對(duì)照組織的基因表達(dá)譜差異，為了把這些基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù)和生物學(xué)功能聯(lián)系起來，我們就要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。此部分實(shí)驗(yàn)通過對(duì)基因表達(dá)譜芯片的檢測結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，找出篩選的差異基因的變化趨勢(shì)及相互作用網(wǎng)絡(luò)。
　　方法:通過基因表達(dá)譜

4、芯片配套軟件Agilent GeneSpring GX v12.0分析第一部分基因表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行GO分析和KEGG生物學(xué)通路富集分析，找出差異基因的變化趨勢(shì)及相互之間的可能作用關(guān)系。
　　結(jié)果:使用基因表達(dá)譜芯片配套軟件Agilent GeneSpring GX v12.0進(jìn)行差異基因功能分類注釋(Gene ontology，GO)分析和基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)的KEGG生物學(xué)通路富集分析，將基因分為上調(diào)基因和下調(diào)基因分別進(jìn)行

5、功能富集分析。
　　第一 GO分析口腔鱗狀細(xì)胞癌組織與癌旁正常對(duì)照組織樣本RNA間的差異基因分布情況如下:
　　1.生物過程部分
　　1.1 上調(diào)基因中生物過程部分:上調(diào)差異基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)共有532個(gè)生物過程的亞層，差異表達(dá)的基因主要富集于刺激反應(yīng)(response to stimulus)(6.75)，免疫系統(tǒng)過程（immune system process）(6.06)，細(xì)胞外基質(zhì)組織(extracellul

6、ar matrix organization)(5.54)，免疫系統(tǒng)過程的調(diào)節(jié)(regulation ofimmune system process)(5.49)，免疫反應(yīng)(immune response)(5.39)，器官形態(tài)(organ morphogenesis)(4.88)，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織(extracellular structureorganization)(4.84)，淋巴細(xì)胞副刺激(lymphocyte costimul

7、ation)(4.77)，T細(xì)胞副刺激(T cell costimulation)(4.77)，細(xì)胞活化的正調(diào)節(jié)(positive regulationof cell activation)(4.75)。
　　1.2 下調(diào)基因中生物過程部分:下調(diào)差異基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)共有715個(gè)生物過程的亞層，差異表達(dá)的基因其中主要集中于:信號(hào)(signaling)(9.70),生物調(diào)節(jié)(biological regulation)(9.29)

8、，死亡(death)(9.12)，細(xì)胞死亡(cell death)(8.98),細(xì)胞過程(cellular process)(8.89)，信號(hào)傳導(dǎo)(signal transduction)(8.74)，細(xì)胞組成活動(dòng)(cellular component movement)(8.69)，創(chuàng)傷反應(yīng)(response to wounding)(8.24),生物質(zhì)量調(diào)節(jié)(regulation of biological quality)(8.1

9、1)，創(chuàng)傷愈合(woundhealing)(7.90)。
　　2.細(xì)胞組分(Cellular Component)
　　2.1 上調(diào)基因中細(xì)胞組分部分:上調(diào)差異基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)共有41個(gè)細(xì)胞組分的亞層，差異表達(dá)的基因其中主要集中于細(xì)胞外區(qū)域部分(extracellularregion part)(12.14)，細(xì)胞外區(qū)域(extracellular region)(12.14)，細(xì)胞外空間(extracellular s

10、pace)(10.91)，質(zhì)膜部分(plasma membrane part)(7.69)，質(zhì)膜必需的(integral to plasma membrane)(7.50)，質(zhì)膜固有的(intrinsic to plasmamembrane)(7.49)，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix)(6.00)，纖維膠原蛋白(fibrillarcollagen)(5.53)，質(zhì)膜(plasma membrane)(5.02)，

11、細(xì)胞周圍(cell periphery)(4.93)。
　　2.2 下調(diào)基因中細(xì)胞組分部分:下調(diào)差異基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)共有149個(gè)細(xì)胞組分的亞層，差異表達(dá)的基因其中主要集中于:細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)(18.17),細(xì)胞質(zhì)部分(cytoplasmic part)(11.18)，細(xì)胞內(nèi)部分(intracellular part)(9.07),質(zhì)膜(plasma membrane part)(9.01)，細(xì)胞內(nèi)（intracel

12、lular）(8.88)，細(xì)胞組成(cell fraction)(8.79)，胞液(cytosol)(8.77)，不溶組成(insoluble fraction)(8.65)，細(xì)胞膜組成(membrane fraction)(7.99)，細(xì)胞周圍（cell periphery）(7.31)。
　　第二 基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)的KEGG生物學(xué)通路富集分析
　　根據(jù)最新KEGG數(shù)據(jù)庫，我們進(jìn)行基因表達(dá)差異數(shù)據(jù)的pathway分析。<

13、br>　　結(jié)論:通過生物信息學(xué)分析我們發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細(xì)胞癌差異基因富集于三大類共1666個(gè)亞類，主要集中于免疫、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)等生物過程方面，質(zhì)膜、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、膠原蛋白、細(xì)胞外區(qū)域等細(xì)胞組成方面和與蛋白、糖、酶、激酶、跨膜受體等結(jié)合的細(xì)胞功能方面。而這些方面的變化與腫瘤細(xì)胞的粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。由此可見腫瘤的發(fā)生發(fā)展不是單個(gè)或幾個(gè)信號(hào)通路的作用結(jié)果，是多個(gè)信號(hào)通路呈網(wǎng)絡(luò)相互調(diào)節(jié)作用的結(jié)果，這個(gè)網(wǎng)絡(luò)的作用關(guān)系是非常復(fù)雜，

14、是參與腫瘤發(fā)生的多信號(hào)通路的綜合作用結(jié)果。
　　第三部分口腔鱗狀細(xì)胞癌差異基因的熒光定量RT-PCR表達(dá)驗(yàn)證
　　目的:本實(shí)驗(yàn)部分通過第一部分基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)組前期蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的口腔鱗狀細(xì)胞癌52種差異蛋白作用網(wǎng)絡(luò)共同分析，篩選出表達(dá)變化趨勢(shì)相同且差異相對(duì)較大的基因，通過熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證這些差異基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁對(duì)照組織中的表達(dá)，從而確定差異基因的表達(dá)及基因表達(dá)譜芯片的可靠性，進(jìn)而研究各

15、差異基因之間的可能作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.需要進(jìn)行熒光定量RT-PCR驗(yàn)證的差異基因的確認(rèn)方法:在前期課題組經(jīng)典蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)采用Bio-Rad雙向電泳系統(tǒng)進(jìn)行一向等電聚焦和二向垂直電泳篩選出的52種口腔鱗狀細(xì)胞癌差異蛋白中，我們綜合基因表達(dá)譜芯片檢測結(jié)果，選擇與52種差異蛋白對(duì)應(yīng)基因變化一致且相對(duì)變化較大的基因。我們共選出15個(gè)目標(biāo)基因，其中表達(dá)上調(diào)的基因有6個(gè)，分別為:GNB2L1、ARHGDIB、STMN1、LG

16、ALS7、EIF5A、TAGLN。表達(dá)下調(diào)的基因有9個(gè)，分別為:S100A7、S100A8、S100A9、ANXA1、ANXA2、ANXA5、CSTB、CRYAB、 SERPINB3。
　　2.在廣東省口腔醫(yī)院等多個(gè)醫(yī)院收集口腔鱗狀細(xì)胞癌患者32例，每例患者采集口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁正常對(duì)照組織作為一組，通過熒光定量RT-PCR進(jìn)行較大樣本的表達(dá)驗(yàn)證。
　　結(jié)果:經(jīng)過熒光定量RT-PCR驗(yàn)證（GAPDH為內(nèi)參）后，差異基因

17、(GNB2L1、ARHGDIB、STMN1、LGALS7、EIF5A、TAGLN)表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。差異基因（S100A7、S100A8、S100A9、ANXA1、ANXA2、ANXA5、CSTB、CRYAB、SERPINB3）表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。熒光定量RT-PCR驗(yàn)證差異基因的變化趨勢(shì)與基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)結(jié)果具有很好的一致性。
　　結(jié)論:熒光定量RT-PCR技術(shù)是驗(yàn)證基

18、因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)最精確的技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)我們采用熒光定量RT-PCR技術(shù)對(duì)較大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明熒光定量RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與基因表達(dá)譜芯片結(jié)果一致。鑒于差異基因經(jīng)熒光定量RT-PCR驗(yàn)證與芯片基因表達(dá)一致，認(rèn)為Roche NimbleGen全基因組表達(dá)譜芯片結(jié)果的可信性較高。通過基因表達(dá)譜芯片的檢測和熒光定量RT-PCR的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細(xì)胞癌組織具有很多的差異基因、蛋白，而不是一個(gè)或者幾個(gè)基因發(fā)生改變，也指示我們要研究