直腸癌相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析及實(shí)驗(yàn)室初步驗(yàn)證.pdf

1、目的：結(jié)直腸腺癌(colorectal adenocarcinoma，CRA)是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，占消化道惡性腫瘤的第二位，且呈逐漸增高的趨勢(shì)。目前的研究認(rèn)為從正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞到結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的演變是多步驟、多基因逐步發(fā)展的結(jié)果，其發(fā)生發(fā)展過程與多個(gè)基因的時(shí)空異常表達(dá)以及蛋白質(zhì)的相互作用有關(guān)。因此研究結(jié)直腸腺癌相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)研究結(jié)直腸腺癌病變分子機(jī)理具有重要意義。 從抑制性消減雜交結(jié)合cDNA芯片技術(shù)篩選

2、發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)的表達(dá)序列標(biāo)簽(expression sequence tag，EST)中，選擇四個(gè)EST片段，基因登錄號(hào)分別為ES274071、：ES274070、ES274084、ES274075 <'[1]>。為進(jìn)一步研究其與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其所代表的基因進(jìn)行一系列的生物信息學(xué)分析并實(shí)驗(yàn)室初步驗(yàn)證。 方法：本實(shí)驗(yàn)中，首先將ES274071這個(gè)EST片段(420bp)作為種子序列，通過生物信息學(xué)的方法，利用

3、Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)，電子克隆并通過DNASTAR軟件拼接得到這一個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行開放讀碼框(open reading frame，ORF)的預(yù)測(cè)、染色體定位、基因的組織表達(dá)譜分析，及其所編碼的蛋白質(zhì)同源性分析，二級(jí)結(jié)構(gòu)及其功能的預(yù)測(cè)等。然后利用RT—PCR方法對(duì)拼接的片段進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并將ES274071的測(cè)序結(jié)果提交至Genbank，基因登錄號(hào)為EF534308。對(duì)另一個(gè)EST片段ES274070，本實(shí)驗(yàn)也對(duì)其

4、所代表的基因序列進(jìn)行了ORF的實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證。對(duì)ES274084和ES274075進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。 結(jié)果：通過網(wǎng)上電子克隆并利用DNASTAR軟件拼接了ES274071的全長(zhǎng)cDNA序列，長(zhǎng)度為2790bp，比原來的EST片段(420bp)在5’端延伸了1550 bp，3’端延伸了820 bp。其定位于人類染色體的9q34，ORF預(yù)測(cè)為834bp并通過測(cè)序加以驗(yàn)證，其編碼蛋白質(zhì)為SETtranslocation，其中在29-2

5、25位有一個(gè)核小體組裝蛋白(Nucleosome AssemblyProtein，NAP)區(qū)域。同時(shí)在NCBI網(wǎng)站的Unigene數(shù)據(jù)庫(kù)里發(fā)現(xiàn)有一已知序列與其同源，基因登陸號(hào)為NM003011，長(zhǎng)度為2577 bp，而本實(shí)驗(yàn)通過拼接得到的全長(zhǎng)序列較這個(gè)已登陸的序列在5’端延伸了305 bp。另一個(gè)EST即ES274070所到表基因的ORF為336bp，利用DNA測(cè)序技術(shù)加以驗(yàn)證。ES274084和ES274075經(jīng)分析實(shí)際為同一序列，其

6、所代表基因的編碼蛋白可能為Ⅰ型膠原蛋白。 結(jié)論：將組裝的ES274071的eDNA的ORF序列所編碼的蛋白進(jìn)行blastp檢索發(fā)現(xiàn)其編碼蛋白為SETtranslocatio。SET是腫瘤抑制因子NM23(Non-metastatic gene)及蛋白質(zhì)磷酸脂酶2A(protein phosphatase2A，PP2A)的抑制劑。PP2A是一種磷酸化酶，屬于抑癌蛋白，過度表達(dá)能夠?qū)е录?xì)胞周期障礙，它可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)及分化，而