微藻整合表達(dá)載體構(gòu)建及ACCase的生物信息學(xué)分析.pdf

1、生物柴油作為石化燃料的替代能源，已在國際上得到了廣泛的應(yīng)用。利用基因工程技術(shù)獲得高油脂微藻，是當(dāng)今國際上開發(fā)生物柴油的有前景的方向之一。藍(lán)藻作為一種簡單的原核光合生物，生長迅速，油脂含量較高;同時(shí)適應(yīng)性強(qiáng)，便于遺傳操作，通過基因工程改造適合作為生物柴油的原料。乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)是脂肪酸代謝中的關(guān)鍵酶，在生物體內(nèi)催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A的反應(yīng)，這是脂肪酸從頭合成的第一步也是限速步驟。
　　 本研究主要包括整

2、合表達(dá)載體的構(gòu)建和微藻ACCase的生物信息學(xué)分析兩部分。
　　 （一）成功構(gòu)建了藍(lán)藻pAnFP整合表達(dá)載體，并克隆了魚腥藻7120(Anabaena sp.PCC7120)編碼乙酰輔酶A羧化酶CT-β亞基的accD基因。構(gòu)建的藍(lán)藻pAnFP整合表達(dá)載體包括整合片段F（有兩個(gè)側(cè)翼的整合片段F1和F2），啟動(dòng)子PpsbAl，以及帶有自己啟動(dòng)子的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因nptⅡ。利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，從魚腥藻7120基因組DNA獲得兩個(gè)整

3、合片段F1和F2以及啟動(dòng)子PpsbAl，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因nptⅡ來自原核表達(dá)載體pET30。accD基因克隆到載體pBS-T上，經(jīng)DNA序列測(cè)定確定此基因即為魚腥藻7120ACCase CT-β功能域基因。
　　 （二）采用生物信息學(xué)的方法對(duì)不同藍(lán)藻ACCase的各亞基的理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜區(qū)、疏水性/親水性、蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了生物信息分析與預(yù)測(cè)，并構(gòu)建不同物種ACCase各亞基的系統(tǒng)進(jìn)化樹。藍(lán)藻ACCase的BC

4、亞基和BCCP亞基是不穩(wěn)定蛋白，并且沒有明顯的卷曲結(jié)構(gòu);CT-α亞基和CT-β亞基為穩(wěn)定蛋白，具有明顯的卷曲結(jié)構(gòu);四個(gè)亞基均無信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，BC亞基的保守結(jié)構(gòu)域最多有7個(gè);二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，零星散布著少量的延伸鏈。在ACCase進(jìn)化關(guān)系上，不同亞基的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系有一定差異性，但總的來說類似于相近物種的親緣關(guān)系也相近，原核藍(lán)藻ACCase之間進(jìn)化距離最近，表明其進(jìn)化途徑非常穩(wěn)定，是由同一個(gè)祖先共同進(jìn)化而來的;其次是