人正常晶狀體蛋白質(zhì)表達譜的構(gòu)建和生物信息學分析.pdf

1、中國醫(yī)科大學博士學位論文人正常晶狀體蛋白質(zhì)表達譜的構(gòu)建和生物信息學分析姓名：姚志斌申請學位級別：博士專業(yè)：眼科指導(dǎo)教師：張勁松20090401仍按上述步驟進行操作，如此反復(fù)三次，合并三次上清液主要為晶狀體水溶性蛋白質(zhì)成分。剩余的沉淀物將其再溶于裂解緩沖液(7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，50raMTrisHCLpn74)中，超聲勻漿(超聲180s)，依然按上述方法離心，收集上清液，重復(fù)上述步驟三次，合并三次上清液主要為晶狀體水不溶性

2、蛋白質(zhì)成分l，剩余沉淀物再溶于4％SDS，3％巰基乙醇，50mMTrisC1(pH88)的緩沖液中煮沸5分鐘，超聲勻漿，依然按上述方法離心，收集上清液，重復(fù)上述步驟三次，合并三次上清液主要為晶狀體水不溶性蛋白質(zhì)成分2，最終將剩余的少量沉淀物棄去。應(yīng)用BradFord法(使用牛血清白蛋白BSA作為標準蛋白)對晶狀體水溶性蛋白質(zhì)成分、水不溶性蛋白質(zhì)成分1進行蛋白定量后，加入SDSPAGE上樣緩沖液(50mmol／1Tris—HCl，pH83

3、，2％SDS，5％p巰基乙醇和5％甘油)950C加熱5min。配置12％SDSPAGE不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠(濃縮膠5％，分離膠12％)初步分離晶狀體蛋白質(zhì)：晶狀體水溶性蛋白質(zhì)成分和晶狀體水不溶性蛋白質(zhì)成分1，每泳道各上樣量為15pg。水不溶性蛋白溶液2直接上樣。電泳電流30__45mA，電壓8旺120mV，溴酚藍到達膠的底端附近(O51cm)停止電泳。采用考馬斯亮藍R250染色，染色后SDSPAGE膠圖及切膠位點見附圖3，將每個條帶的膠

4、分別切成約lmm的小塊，分別放于微量離心管中(碳酸氫氨：乙腈1：1)脫色，加乙腈使膠塊脫水，然后加DTT在56℃下加熱30分鐘還原樣品，再加碘乙酰胺烷基化在暗處30分鐘，凍干，加入測序級胰蛋白酶溶液(01mg／m1)，于37℃水浴酶解16個小時，以三氟乙酸(TFA)水溶液提取酶解肽段。酶解肽段分別用輔助泵以30此／min的流速由自動采樣器首先進樣到3001xrnidx5mmZorbax300SBC18預(yù)柱(AgilentTechnolo

5、gies，WilmingtonDE)上除鹽20min，然后切換到75Innid150n1mRPC18分析柱(毛細管反相柱，ColumnTechnologyInc)進行線性梯度洗脫，流速設(shè)定為20此／min，流動相A液為O1％甲酸的水溶液，流動相B液為01％甲酸的乙腈水溶液(乙腈為84％)；045分鐘，4％一50％B液；45～54分鐘，50％100％B液；54“120分鐘，B液維持在100％。分離后的餾分通過ESI源進行LTQ線性離子阱串