兒童惡性血液病血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究及生物信息學(xué)分析.pdf

1、第一部分應(yīng)用iTRAQ技術(shù)聯(lián)合2D LC-MS/MS篩選兒童惡性血液病血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物
　　背景與目的:惡性血液病是兒童時(shí)期常見的惡性腫瘤，目前其診斷主要依靠骨髓或淋巴結(jié)穿刺活檢，但因其損傷較大致使患兒依從性差;近年來隨著合理規(guī)范化療及治療策略的不斷創(chuàng)新，惡性血液病的預(yù)后有了很大改善，然而仍有一部分患兒難以達(dá)到完全緩解或復(fù)發(fā)，并且傳統(tǒng)的化療藥物毒副作用大造成化療相關(guān)性死亡率高，因此惡性血液病急需尋找非侵襲性和特異性的早期診斷標(biāo)志物

2、和治療靶點(diǎn)。同位素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)標(biāo)記的二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(2DLC-MS/MS）聯(lián)合生物信息分析軟件系統(tǒng)(IPA)的使用，是尋找差異蛋白、篩選蛋白分子標(biāo)志物的理想工具。本研究聯(lián)合iTRAQ-2DLC-MS/MS與IPA技術(shù)篩選兒童惡性血液病的血清差異表達(dá)蛋白，探討惡性血液病診斷、治療的新靶點(diǎn)以及可能的發(fā)病機(jī)制。
　　方法:
　　1.分別收集兒童初治急性B淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)、急性T淋巴細(xì)胞白血病

3、(T-ALL)、急性粒細(xì)胞白血病部分分化型(M2)、急性早幼粒細(xì)胞白血病(M3)、急性單核細(xì)胞白血?。∕5）、B細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤（B-NHL），T細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤（T-NHL）血清各20例作為實(shí)驗(yàn)組，收集同期體檢正常兒童血清20例作為對(duì)照組。等量混合各組血清標(biāo)本，提取蛋白后應(yīng)用多重親和去除系統(tǒng)(MARS)去除血清中14種高豐度蛋白，超濾除鹽后采用Bradford法測(cè)定總蛋白濃度。
　　2.應(yīng)用iTRAQ試劑標(biāo)記經(jīng)胰酶消化后

4、的肽段，113標(biāo)記正常兒童對(duì)照組，114標(biāo)記B-ALL組，115標(biāo)記T-ALL組，116標(biāo)記M2組，117標(biāo)記M3組，118標(biāo)記M5組，119標(biāo)記B-NHL組，121標(biāo)記T-NHL組。將標(biāo)記后的肽段混合，運(yùn)用二維高效反相液相色譜進(jìn)行分離，然后串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)樣品進(jìn)行分析鑒定。
　　3.根據(jù)所鑒定出蛋白質(zhì)的iTRAQ相對(duì)定量值，通過對(duì)兒童惡性血液病各組與正常對(duì)照組的蛋白表達(dá)量分別進(jìn)行比較，篩選出差異倍數(shù)在1.2倍以上（上調(diào)或下調(diào)）的差異蛋

5、白。
　　4.應(yīng)用生物信息學(xué)軟件IPA分別分析惡性血液病各組與正常對(duì)照組的差異表達(dá)蛋白，獲得各組差異蛋白的生物功能以及參與的信號(hào)通路和蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò);查閱差異蛋白相關(guān)文獻(xiàn)并根據(jù)IPA分析結(jié)果初步篩選出有意義的血清差異表達(dá)蛋白。
　　5.采用ELISA雙抗夾心法分別檢測(cè)了50例B-ALL、20例T-ALL、20例M2、20例M3、20例M5、20例B-NHL、20例T-NHL和30例正常兒童對(duì)照組的血清LRG1、S100A

6、8和SPARC表達(dá)水平，并計(jì)算其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義來驗(yàn)證質(zhì)譜的準(zhǔn)確性，進(jìn)一步篩選與兒童惡性血液病相關(guān)的生物標(biāo)記物。
　　結(jié)果:
　　1.應(yīng)用iTRAQ-2DLC-MS/MS技術(shù)，比較兒童惡性血液病各組和對(duì)照組血清差異蛋白，篩查與惡性血液病相關(guān)的血清標(biāo)志物。質(zhì)譜鑒定總共得到534個(gè)非冗余蛋白質(zhì)，以正常兒童對(duì)照組蛋白質(zhì)作為對(duì)照，分別計(jì)算各組表達(dá)值與正常對(duì)照組比值，設(shè)定其比值＞1.2或＜0.8（即差異倍數(shù)＞1.2且P＜0.05）為明顯上調(diào)

7、或下調(diào)蛋白，即各組有意義的血清差異表達(dá)蛋白。
　　2.兒童惡性血液病各組的差異蛋白及其相關(guān)信號(hào)通路與關(guān)聯(lián)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)
　　(1)B-ALL組的血清差異蛋白共有81個(gè)，其中上調(diào)20個(gè)，下調(diào)61個(gè);經(jīng)IPA軟件分析顯示這些差異蛋白主要分布在與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和交互(Cell-To-CellSignaling and Interaction)、組織發(fā)育(Tissue Development)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(CellularMoveme

8、nt)、免疫細(xì)胞運(yùn)輸（Immune Cell Trafficking）、心血管疾病(Cardiovascular Disease)、血液系統(tǒng)的發(fā)育和功能(Hematological SystemDevelopment and Function)等相關(guān)的功能中;而參與的主要信號(hào)通路包括Acute Phase Response Signaling、 LXR/RXR Activation、Coagulation System、Intrinsi

9、c Prothrombin Activation Pathway、 Atherosclerosis Signaling以及Extrinsic Prothrombin Activation Pathway通路等;差異蛋白共參與4個(gè)主要的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（參與網(wǎng)絡(luò)的目的差異蛋白超過9個(gè)）。
　　(2)T-ALL組的血清差異蛋白共有85個(gè)，其中上調(diào)43個(gè)，下調(diào)42個(gè);經(jīng)IPA軟件分析顯示這些差異蛋白主要分布在與Cell-To-Cell

10、Signaling andInteraction、Tissue Development、Cellular Movement、Immune Cell Trafficking、Cardiovascular Disease、Hematological System Development and Function等相關(guān)的功能中;而參與的主要信號(hào)通路包括Acute Phase Response Signaling、LXR/RXR Activat

11、ion、 Atherosclerosis Signaling、 Clathrin-mediatedEndocytosis Signaling、 Production of Nitric Oxide and Reactive OxygenSpecies in Macrophages、IL-12 Signaling and Production in Macrophages、Agranulocyte Adhesion and Diapede

12、sis通路等;此外差異蛋白共參與6個(gè)主要的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（參與網(wǎng)絡(luò)的目的蛋白超過9個(gè)）。
　　(3)M2組的血清差異蛋白共有91個(gè)，其中上調(diào)27個(gè)，下調(diào)64個(gè);經(jīng)IPA軟件分析顯示這些差異蛋白主要分布在與Cellular Movement、Immune CellTrafficking、 Cardiovascular Disease、Cell-To-Cell Signaling and Interaction、Tissue Dev

13、elopment、Organismal Injury and Abnormalities、HematologicalSystem Development and Function、Hematological Disease等相關(guān)的功能中;而參與的主要信號(hào)通路包括LXR/RXR Activation、 Acute Phase Response Signaling、 Coagulation System、 Atherosclerosis S

14、ignaling、 Intrinsic ProthrombinActivation Pathway、 Clathrin-mediated EndocytosisSignaling、 IL-12 Signalingand Production in Macrophages、 Production of Nitric Oxide and ReactiveOxygen Species in Macrophages通路等;此外差異蛋白共參與5個(gè)

15、主要的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（參與網(wǎng)絡(luò)的目的蛋白超過9個(gè)）。
　　(4) M3組的血清差異蛋白共有83個(gè)，其中上調(diào)33個(gè)，下調(diào)50個(gè);經(jīng)IPA軟件分析顯示這些差異蛋白主要分布在與Cellular Movement、 Immune CellTrafficking、 Hematological System Development and Function、 Cell-To-CellSignaling and Interaction、 Ti

16、ssue Development、 Cardiovascular Disease、Inflammatory Response等相關(guān)的功能中;而參與的主要信號(hào)通路包括LXR/RXR Activation、 Acute Phase Response Signaling、 AtherosclerosisSignaling、 Complement System、 Production of Nitric Oxide and ReactiveOx

17、ygen Species in Macrophages、 IL-12 Signaling and Production inMacrophages通路等;此外差異蛋白共參與5個(gè)主要的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（參與網(wǎng)絡(luò)的目的蛋白超過11個(gè)）。
　　(5) M5組的血清差異蛋白共有84個(gè)，其中上調(diào)26個(gè)，下調(diào)58個(gè);經(jīng)IPA軟件分析顯示這些差異蛋白主要分布在與Cardiovascular Disease、 Cell-To-CellSignal

18、ing and Interaction、 Tissue Development、 Metabolic Disease、Hematological Disease、 Hematological System Development and Function、Organismal Functions、 Immune Cell Trafficking等相關(guān)的功能中;而參與的主要信號(hào)通路包括Acute Phase Response Signal

19、ing、 LXR/RXR Activation、Complement System、 Atherosclerosis Signaling、 CoagulationSystem、 IL-12Signaling and Production in Macrophages、 Production of Nitric Oxide andReactive Oxygen Species in Macrophages通路等;此外差異蛋白共參與5個(gè)主要

20、的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（參與網(wǎng)絡(luò)的目的蛋白超過11個(gè)）。
　　(6) B-NHL組的血清差異蛋白共有79個(gè)，其中上調(diào)34個(gè)，下調(diào)45個(gè);經(jīng)IPA軟件分析顯示這些差異蛋白主要分布在與Cell-To-Cell Signaling and Interaction、Tissue Development、 Metabolic Disease、 Cellular Movement、 Immune CellTrafficking、 Hematolo

21、gical System Development and Function等相關(guān)的功能中;而參與的主要信號(hào)通路包括Acute Phase Response Signaling、 LXR/RXRActivation、 Intrinsic Prothrombin Activation Pathway、 CoagulationSystem、 Extrinsic Prothrombin Activation Pathway、Atheroscle

22、rosis Signaling通路等;此外差異蛋白共參與4個(gè)主要的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（參與網(wǎng)絡(luò)的目的蛋白超過11個(gè)）。
　　(7) T-NHL組的血清差異蛋白共有73個(gè)，其中上調(diào)45個(gè)，下調(diào)28個(gè);經(jīng)IPA軟件分析顯示這些差異蛋白主要分布在與Organismal Injury and Abnormalities、Metabolic Disease、 Cardiovascular Disease、 Cell-To-Cell Signa

23、ling andInteraction、Tissue Development、Cellular Movement、Hematological SystemDevelopment and Function、Immune Cell Trafficking等相關(guān)的功能中;而參與的主要信號(hào)通路包括Acute Phase Response Signaling、 LXR/RXR Activation、Atherosclerosis Signalin

24、g、Production of Nitric Oxide and Reactive OxygenSpecies in Macrophages、 Clathrin-mediated EndocytosisSignaling、 IL-12Signaling and Production in Macrophages通路等;此外差異蛋白共參與4個(gè)主要的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（參與網(wǎng)絡(luò)的目的蛋白超過11個(gè)）。
　　3.ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示血清

25、LRG1、S100A8和SPARC蛋白的表達(dá)情況與iTRAQ結(jié)果一致。ELISA結(jié)果驗(yàn)證了LRG1和S100A8在兒童惡性血液病血清中表達(dá)上調(diào);SPARC蛋白在兒童急性白血病(Acute Leukemia)血清中表達(dá)水平下調(diào)，而在兒童NHL血清中無變化。
　　結(jié)論:
　　1.本研究首次應(yīng)用iTRAQ-2DLC-MS/MS聯(lián)合IPA技術(shù)篩選兒童惡性血液病血清的蛋白分子標(biāo)志物，具有較高的重復(fù)性和精確性，共鑒定到534個(gè)非冗余蛋白

26、質(zhì)。得到了大量可靠的差異蛋白質(zhì)信息，B-ALL組的差異蛋白共有81個(gè)，其中上調(diào)20個(gè)，下調(diào)61個(gè);T-ALL組的血清差異蛋白85個(gè)，其中上調(diào)43個(gè)，下調(diào)42個(gè);M2組的血清差異蛋白91個(gè)，其中其中上調(diào)27個(gè)，下調(diào)64個(gè);M3組的血清差異蛋白83個(gè)，其中上調(diào)33個(gè)，下調(diào)50個(gè);M5組的血清差異蛋白84個(gè)，其中其中上調(diào)26個(gè)，下調(diào)58個(gè);B-NHL組的血清差異蛋白79個(gè)，其中上調(diào)34個(gè)，下調(diào)45個(gè);T-NHL組的血清差異蛋白73個(gè)，其中上調(diào)

27、45個(gè)，下調(diào)28個(gè);為兒童惡性血液病早期診斷提供非侵襲性的手段及治療提供潛在的靶點(diǎn)，并為進(jìn)一步研究?jī)和瘣盒匝翰】赡艿陌l(fā)病分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　2.采用IPA生物信息學(xué)方法對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能及其涉及的信號(hào)通路進(jìn)行分析，功能分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要集中于細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與相互作用、血液系統(tǒng)的發(fā)育和功能、組織發(fā)育、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、免疫細(xì)胞運(yùn)輸?shù)?進(jìn)行IPA通路分析，發(fā)現(xiàn)大部分差異蛋白集中于Acute Phase Response

28、Signaling、LXR/RXR Activation、 Atherosclerosis Signaling、 IL-12 Signaling andProduction in Macrophages四個(gè)通路，為兒童惡性血液病發(fā)病機(jī)制提供了研究線索。
　　3.采用ELISA對(duì)3個(gè)候選蛋白LRG1、S100A8和SPARC在血清中的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。其中S100A8和LRG1在兒童惡性血液病中表達(dá)上調(diào)，SPA

29、RC在兒童AL中表達(dá)下調(diào)，提示S100A8、LRG1可能與兒童惡性血液病發(fā)病有關(guān)，SPARC可能與AL發(fā)病有關(guān)，可作為潛在的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，并需要在臨床中進(jìn)行廣泛的驗(yàn)證。
　　4.SPARC可作為鑒別兒童AL與NHL的蛋白標(biāo)志物。
　　第二部分應(yīng)用SERPA技術(shù)篩選兒童急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)抗原及自身抗體
　　背景與目的:急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）是兒童時(shí)期最常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，約占15歲以下兒童惡性腫瘤

30、發(fā)病率的25％，其中最常見的類型為急性B淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)。目前其診斷主要依靠骨髓穿刺，但因損傷較大患兒依從性差;近年來由于聯(lián)合化療和支持治療的不斷完善，兒童ALL的預(yù)后有了很大改善，但ALL的發(fā)病機(jī)制至今不清;化療難以根除微小殘留病變獲得長(zhǎng)期緩解，仍有約20％的ALL患兒復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后再次化療常常無效，并且傳統(tǒng)的化療藥物對(duì)白血病細(xì)胞的殺傷作用是非特異性的，其在殺傷白血病細(xì)胞的同時(shí)也殺傷正常的造血細(xì)胞，產(chǎn)生嚴(yán)重的中性粒細(xì)胞缺乏和

31、血小板減少等造成化療相關(guān)性死亡。因此，應(yīng)用靶向治療方法特異性地殺滅白血病細(xì)胞是目前急需解決的問題。越來越多的證據(jù)表明在白血病患者體內(nèi)存在著特異性免疫反應(yīng)，雖然白血病發(fā)病初期血清中的許多抗原由于表達(dá)豐度很低不易檢測(cè)，但機(jī)體免疫系統(tǒng)已經(jīng)能夠監(jiān)測(cè)到這些抗原的存在，并產(chǎn)生大量針對(duì)該抗原的特異性自身抗體。血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析(SERRA)是將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合的一種高通量篩選腫瘤相關(guān)抗原及自身抗體的新技術(shù)，本研究應(yīng)用SERRA技術(shù)以人

32、B-ALL細(xì)胞株NALM-6、REH及BALL-1的總蛋白作為腫瘤抗原來篩選兒童B-ALL相關(guān)抗原及自身抗體，為兒童B-ALL的早期診斷及治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.首先提取人B-ALL細(xì)胞株NALM-6、REH及BALL-1的總蛋白等量混合作為B-ALL抗原來源，再應(yīng)用雙向電泳(2-DE)根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)、分子量的不同對(duì)總蛋白進(jìn)行分離，獲得3張相同的凝膠，其中一塊2-DE凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色作為平行膠，其余兩塊凝膠

33、經(jīng)電轉(zhuǎn)印將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，然后分別與B-ALL患兒血清及正常兒童對(duì)照血清進(jìn)行免疫印跡（Western Blot），獲得免疫印跡反應(yīng)圖譜。經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像分析，通過匹配免疫印跡圖譜與2-DE凝膠圖譜進(jìn)而識(shí)別差異反應(yīng)的蛋白點(diǎn)（與B-ALL血清反應(yīng)陽性而與正常兒童血清反應(yīng)陰性的點(diǎn)），然后在平行的2-DE凝膠上找到與Western Blot中差異反應(yīng)蛋白質(zhì)點(diǎn)相匹配的蛋白質(zhì)點(diǎn)，再對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行胰酶酶切及MALDI-TOF/TOF-MS/MS質(zhì)

34、譜鑒定，從而確定在血清中存在自身抗體的相關(guān)抗原，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　2.為進(jìn)一步驗(yàn)證篩選得到的B-ALL相關(guān)抗原的自身抗體特異性，采用間接ELISA方法檢測(cè)其中兩個(gè)蛋白質(zhì)α-烯醇化酶(ENO1)與電壓依賴性陰離子通道蛋白1(VDAC1)的自身抗體在30例B-ALL患兒、30例其他腫瘤患兒及25例正常兒童血清中的陽性率。
　　3.采用免疫組織化學(xué)方法比較ENO1與VDAC1在兒童B-ALL骨髓與正常兒童骨髓中的表達(dá)差異。

35、>　　4.應(yīng)用Western Blot檢測(cè)ENO1與VDAC1在三株B-ALL細(xì)胞株NALM-6、REH及BALL-1的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:
　　1.應(yīng)用SERRA技術(shù)，在B-ALL細(xì)胞株平行膠上篩選出6個(gè)差異反應(yīng)蛋白點(diǎn)（與B-ALL兒童血清反應(yīng)陽性而與正常兒童血清反應(yīng)陰性的點(diǎn)），通過質(zhì)譜鑒定和查詢數(shù)據(jù)庫，6個(gè)蛋白點(diǎn)分別鑒定為線粒體順烏頭酸酶(aconitase)、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)、二氫硫辛酰胺脫氫酶(DLD)、EN

36、O1、中鏈脂?；o酶A脫氫酶(MCAD)、VDAC1。
　　2.ELISA結(jié)果顯示ENO1與VDAC1的自身抗體在B-ALL兒童血清中的陽性率分別為27％和23％，明顯高于正常兒童（4％和0），但不高于其他腫瘤患者(23％和17％)。
　　3.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示ENO1與VDAC1在兒童B-ALL骨髓均明顯高于正常兒童骨髓中的表達(dá)。
　　4.Western Blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)ENO1與VDAC1蛋白表達(dá)水平在三株B