與骨纖維異常增殖癥相關(guān)的MicroRNA分析.pdf

1、研究背景：骨纖維異常增殖癥為骨內(nèi)纖維組織代替骨組織的增生過程。多見于兒童及青少年時(shí)期發(fā)病。女性多見,男女比例約為1:2?；颊哳M骨呈進(jìn)行性腫大，青春期后可停止發(fā)展或速度減慢。多見于上頜骨及顴骨?？蔀閱喂切?，也可為多骨性。多骨性最常見于顱骨、頜骨，還可累及肋骨、骨盆及長骨。后期常引起頜面畸形及咬合功能障礙或眼球移位、鼻塞等癥狀。 目前對(duì)于骨纖維異常增殖癥的基礎(chǔ)研究集中在：骨形成蛋白基因等少數(shù)已經(jīng)報(bào)道的致病基因和突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)更多骨纖

2、維異常增殖癥致病基因及深入探索其致病機(jī)制是骨纖維異常增殖癥基礎(chǔ)研究的重要方向。本課題擬采用MicroRNA芯片探索與骨纖維異常增殖癥相關(guān)的基因，為后續(xù)研究提供科學(xué)依據(jù)。 MicroRNA是一種21-25nt長的單鏈小分子RNA。它廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA.其本身不具有開放閱讀框(ORF)。成熟的miRNA，5，端有一個(gè)磷酸基團(tuán)，3’端為羥基。miRNA5’端第一個(gè)堿基對(duì)U(尿苷)有強(qiáng)烈的傾向性，而對(duì)

3、G卻排斥，但第二到第四個(gè)堿基缺乏U。一般來講，除第四個(gè)堿基外，其他位置堿基通常都缺乏C。這些分子能夠與那些和它的序列互補(bǔ)的mRNA分子相結(jié)合，有時(shí)候甚至可以與特定的DNA片斷結(jié)合。這種結(jié)合的結(jié)果就是導(dǎo)致基因的沉默。這種方式是機(jī)體調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一個(gè)重要策略。據(jù)推測(cè)，miRNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因。 研究方法和研究結(jié)果： 本課題收集骨纖維異常增殖癥臨床病例共4例，同時(shí)選取2例正常對(duì)照。在基因芯片實(shí)驗(yàn)中，我們將4例患者患病

4、組織中提取的RNA進(jìn)行等量混合，2例正常對(duì)照也進(jìn)行同樣處理。通過microRNA芯片，發(fā)現(xiàn)患者與正常對(duì)照之間存在的基因表達(dá)差異，然后討論這些存在差異表達(dá)的microRNA的潛在意義。 芯片用LuxScan10K/A.雙通道激光掃描儀(CapitalBio公司)進(jìn)行掃描。之后利用LuxScan3.0圖像分析軟件(CapitalBio公司)對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，再利用SAM軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，我們發(fā)現(xiàn)，在A1樣

5、品中有22個(gè)microRNA表達(dá)明顯上調(diào)，17個(gè)microRNA表達(dá)明顯下調(diào)。在所有表達(dá)上調(diào)的microRNA中，mir-34a/b在病例中表達(dá)上調(diào)最為明顯。而在表達(dá)下調(diào)的microRNA中，mir-1和mir-133a/b是下調(diào)最明顯的3個(gè)microRNA。 獲得以上基因芯片數(shù)據(jù)以后，再次提取正常對(duì)照及患者組織的RNA，并對(duì)提取的RNA進(jìn)行定性、定量分析，采用Northernblot方法對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，mir-3

6、4a/b、mir-181b和mir-20b在病例樣本中表達(dá)上調(diào)明顯；mir-1和mir-133a/b在病例樣本中下調(diào)顯著，與芯片結(jié)果相符。 在證實(shí)上述結(jié)果以后，對(duì)表達(dá)改變顯著的microRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，相關(guān)數(shù)據(jù)和資料顯示，mir-34a/b可以通過影響細(xì)胞周期來抑制細(xì)胞的增殖，但是軟件提示的相關(guān)基因與骨形成關(guān)系不明顯。mir-181b和mir-20b均與VEGF表達(dá)相關(guān)，VEGF全稱是血管內(nèi)皮生長因子(Vascular

7、endothelialgrowthfactor)，是PDGF/VEGF生長因子家族的成員之一，主要在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮功能，其作用包括間接增加血管滲透性；誘導(dǎo)血管新生、血管發(fā)生和內(nèi)皮細(xì)胞生長；促進(jìn)細(xì)胞遷移、抑制細(xì)胞凋亡。在對(duì)骨纖維異常增殖癥患者的手術(shù)中，有一個(gè)顯著特點(diǎn)：患病組織局部出血顯著多于正常組織，提示患者的基因表達(dá)異常中，可能存在與血管生成、發(fā)育相關(guān)的異常。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)、特異性最高的促血管生成因子。所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選

8、取VEGF作為研究靶點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)選取4位患者的組織和血清，通過WesternBlot、RT-PCR和ELISA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了患者VEGF的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：患者VEGF水平在蛋白質(zhì)水平和mRNA水平均顯著升高。這一點(diǎn)改變可以解釋目前在手術(shù)中發(fā)現(xiàn)的患者手術(shù)局部血管豐富、出血較多的表現(xiàn)。 結(jié)論： 實(shí)驗(yàn)首先通過microRNA基因芯片確定了骨纖維異常增殖癥患者與正常對(duì)照之間microRNA的表達(dá)差別，之后應(yīng)用Norther

9、nblot方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)mir-34a/b、mir-181b和mir-20b在病例樣本中表達(dá)上調(diào)明顯；mir-1和mir-133a/b在病例樣本中下調(diào)明顯，這些特異改變可以作為以后基因診斷和基因治療的研究靶點(diǎn)。 在確定表達(dá)改變顯著的microRNA以后，對(duì)這些microRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)mir-181b和mir-20b均與VEGF表達(dá)相關(guān)，實(shí)驗(yàn)從組織水平、血清水平驗(yàn)證了患者組織中和血液中均存在VEG