血清長(zhǎng)鏈非編碼RNAs作為伴乙肝肝癌早期診斷標(biāo)記物的研究.pdf

1、研究背景：
　　 原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是全球第五位最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是近年來(lái)發(fā)病率上升最快、病死率最高的腫瘤之一。在我國(guó)，HBV的高感染性導(dǎo)致慢性肝病、肝硬化的高發(fā)性。據(jù)研究報(bào)道慢性HBV感染者一生中有10-25％的機(jī)率發(fā)展為HCC。因此從HBV感染到最終的肝癌，其間為早期診斷和早期發(fā)現(xiàn)提供了可能。目前常用的高危人群篩查指標(biāo)是血清甲胎蛋白(AFP)檢測(cè)及超聲檢查。AFP是目前公認(rèn)的唯一可用于臨床HCC高危人群篩選及術(shù)后隨訪

2、的肝癌腫瘤標(biāo)志物，但臨床研究表明其敏感性僅36-64％，特異性為79-91％，有1/3左右的HCC可表現(xiàn)為AFP正常，即使AFP升高者，也不能排除慢性肝病、肝硬化等非惡性肝病。超聲檢查通常難以發(fā)現(xiàn)、確認(rèn)小于3cm的腫塊，且超聲醫(yī)師個(gè)體診斷水平的差異對(duì)診斷結(jié)果有很大影響，上述現(xiàn)狀導(dǎo)致HCC難以實(shí)現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)和早期治療，患者預(yù)后差、5年生存率低、病死率高。因此尋找有效的早期篩查及診斷指標(biāo)對(duì)提高肝癌的整體診治水平迫在眉睫。循環(huán)核酸(cfCNA)

3、是一類存在于血液、尿液、腦脊液等循環(huán)系統(tǒng)中的RNA和DNA，目前已有研究證實(shí)循環(huán)核酸和疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，通過(guò)探測(cè)循環(huán)核酸可以達(dá)到診斷疾病的目的，尤其對(duì)于腫瘤，如已有研究證實(shí)血清中的MiroRNA可以用作多種疾病的診斷。
　　 研究目的：
　　 分析來(lái)源于伴乙肝肝癌組織和癌旁組織中特異性表達(dá)的lncRNAs，篩選出癌組織中高表達(dá)的lncRNAs分子，通過(guò)在正常人、乙肝患者及伴乙肝肝癌患者血清中定量驗(yàn)證篩選出的l

4、ncRNAs的表達(dá)情況，從而探討血清中的lncRNAs是否可以作為肝癌早期診斷的標(biāo)記物。
　　 研究方法：
　　 第一部分:lncRNAs在伴乙肝肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)及目的lncRNAs的挑選利用5對(duì)伴乙肝肝癌組織及癌旁組織做基因芯片，建立伴乙肝肝癌組織中特異表達(dá)的lncRNAs譜（差異倍數(shù)＞2倍，P＜0.05）。然后隨機(jī)挑選其中的5個(gè)分子在68對(duì)伴乙肝肝癌組織和癌旁組織中驗(yàn)證組織芯片的可靠性，最后從特異性表達(dá)的

5、lncRNAs中我們挑選了升高倍數(shù)＞5倍的lncRNAs作為我們的候選分子，通過(guò)150例血清樣本（正常血清、乙肝患者血清及伴乙肝肝癌患者血清）的驗(yàn)證，找出血清中存在的，有可能作為早期診斷標(biāo)記物的lncRNAs作為目標(biāo)分子。
　　 第二部分:回顧性大樣本量探索目標(biāo)分子在血清中的表達(dá)情況通過(guò)回顧性的、大樣本的在正常人血清、乙肝患者血清、伴乙肝肝癌患者血清中驗(yàn)證目標(biāo)分子的表達(dá)情況，探討目標(biāo)分子作為伴乙肝肝癌早期診斷標(biāo)記物的可能性、特異

6、性及敏感性，建立使用目標(biāo)分子作為伴乙肝肝癌早期診斷標(biāo)記物的診斷模型。
　　 第三部分:前瞻性驗(yàn)證回顧性數(shù)據(jù)得出的診斷模型的診斷效率應(yīng)用回顧組建立的診斷模型前瞻性的驗(yàn)證適量樣本（正常人血清、乙肝患者血清及伴乙肝肝癌患者血清），從而評(píng)估該診斷模型的診斷效率以及應(yīng)用與臨床實(shí)踐的潛在可能性。
　　 研究結(jié)果：
　　 第一部分:基因芯片結(jié)果顯示伴乙肝肝癌組織和癌旁組織之間存在大量差異表達(dá)的lncRNAs。通過(guò)在伴乙肝肝癌組

7、織和癌旁組織中隨機(jī)驗(yàn)證5個(gè)lncRNAs分子，結(jié)果與芯片結(jié)果一致。在差異表達(dá)的的lncRNAs中升高倍數(shù)（癌組織vs.癌旁組織）＞5倍的lncRNAs共有23個(gè)，通過(guò)在三組血清標(biāo)本（正常血清、乙肝患者血清及伴乙肝肝癌患者血清）中定量驗(yàn)證這23個(gè)lncRNAs分子，經(jīng)過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序證實(shí)所得產(chǎn)物序列與目標(biāo)分子序列一致。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析顯示其中兩個(gè)分子(lncRNA-uc003wbd，lncRNA-AF085935)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p

8、＜0.05)。因此，我們將lncRNA uc003wbd，lncRNA-AF085935選定為目標(biāo)分子進(jìn)行下一步研究。
　　 第二部分:通過(guò)在三組樣本中（正常血清、乙肝患者血清、肝癌患者血清）回顧性驗(yàn)證lncRNA-uc003wbd，lncRNA-AF085935的表達(dá)情況，Real time-PCR結(jié)果顯示lncRNA-uc003wbd，lncRNA-AF085935在三組樣本中的表達(dá)均呈肝癌患者血清＞乙肝患者血清＞正常血清的

9、趨勢(shì)，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，lncRNA-uc003wbd，lncRNA-AF085935診斷肝癌時(shí)ROC曲線下的面積分別為:0.8597，95％可信區(qū)間為0.8221～0.8974，0.8702，95％可信區(qū)間為0.8309～0.9095。以此結(jié)果我們利用logitic回顧模型建立了以lncRNA-uc003wbd，lncRNA-AF085935為基礎(chǔ)的診斷模型:Logit(P=HCC)=-6.859+0.719* uc003wbd+1.

10、804* AF085935，回顧性數(shù)據(jù)顯示該模型具有良好的早期診斷效率，應(yīng)用此模型區(qū)分肝癌患者、乙肝患者及正常人的ROC曲線下面積為:AUC=0.9432，95％可信區(qū)間為0.9195～0.9668; Sensitivity:69.63，Specificity:95.88。
　　 第三部分:Real time-PCR結(jié)果顯示，在前瞻性觀察的隊(duì)列中應(yīng)用以回顧組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)建立的診斷模型具有較好的診斷效率，該模型可以較好的區(qū)分肝癌患者

11、、乙肝患者及正常人群(AUC=0.9496，95％可信區(qū)間為0.9201～0.9791;Sensitivity:65.57，Specificity:99.17)，該模型有可以應(yīng)用與臨床實(shí)踐的潛在可能。
　　 結(jié)論：
　　 1、伴乙肝肝癌組織和癌旁組織中具有特異的lncRNAs表達(dá)譜。
　　 2、血清中存在腫瘤來(lái)源的lncRNAs分子。
　　 3、以lncRNA-、lncRNA-為基礎(chǔ)建立的肝癌早期診斷模型