血漿長鏈非編碼RNAs作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡生物標(biāo)志物的分子流行病學(xué)研究.pdf

1、背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus, SLE）具有復(fù)雜的遺傳背景，涉及編碼基因和非編碼基因，過去普遍認(rèn)為編碼基因在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但很少關(guān)注基因組中的非編碼RNA（non-coding RNA, ncRNA）。按長度大小，具有調(diào)控作用的ncRNA主要分為兩類：≤200 nt的短鏈非編碼RNA（主要為微小 RNA（microRNA,簡稱 miRNA））和>200 nt的長

2、鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA, lncRNA）。大量研究表明miRNA在SLE的發(fā)病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可作為一種新型生物標(biāo)志物用于SLE的診斷和預(yù)后評估。
　　與miRNA相比，lncRNA的種類繁多且數(shù)量龐大，能夠從表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和蛋白質(zhì)代謝等多個層面調(diào)控基因表達(dá)。LncRNA在人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中也起著非常重要的調(diào)控作用。新近研究表明，在SLE患者外周血單核細(xì)胞中，l

3、inc0949（ENST00000500949）和 NEAT1（nuclear enriched abundant transcript1）的表達(dá)水平明顯異常，且與疾病活動度和腎臟受累有關(guān)，NEAT1通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）通路，促進(jìn)相關(guān)趨化因子和炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而參與SLE的發(fā)病過程。
　　由于SLE臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，病情反復(fù)多變，早期診斷困難，因此

4、迫切需要尋求一種新型、特異性及敏感性較高的生物標(biāo)志物用于SLE的診斷和預(yù)后評估。研究證實lncRNA在血漿中穩(wěn)定存在，可作為腫瘤和心血管疾病的早期生物標(biāo)志物和治療靶點，用于疾病的早期篩查、診斷和預(yù)后評估。然而目前，關(guān)于lncRNA在SLE患者中的研究還很有限，且探討血漿lncRNA作為SLE疾病易感性標(biāo)志物的研究尚未見報道。
　　目的：
　　篩選在SLE患者血漿中異常表達(dá)的lncRNAs，并進(jìn)行獨立驗證，評估差異血漿lncR

5、NAs作為SLE輔助診斷的生物標(biāo)志物的價值；利用生物信息學(xué)分析，對差異lncRNAs進(jìn)行功能預(yù)測，探討其在SLE發(fā)病中的作用機(jī)制。
　　方法：
　　本研究共分為兩部分：
　　第一部分：SLE患者血漿差異lncRNAs的篩選、驗證及作為生物標(biāo)志物的價值本部分采用的是四階段病例?對照設(shè)計：
　　第一階段：收集新發(fā)SLE非腎炎患者、新發(fā)狼瘡腎炎（lupus nephritis, LN）患者和正常對照血漿各12例，各組每

6、4例血漿總RNA等量混合，即形成每組各3份血漿總RNA池。利用lncRNA芯片檢測血漿lncRNA表達(dá)譜，篩選差異lncRNAs。
　　第二階段：小樣本初步驗證，在原單個血漿標(biāo)本中，采用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR）技術(shù)，對從芯片中篩選出的10個候選差異lncRNAs和根據(jù)文獻(xiàn)挑選的5個候選lncR

7、NAs（ENST00000500597: linc0597; ENST00000500949: linc0949; ENST00000449289:GAS5或lnc9289;ENST00000587298:lnc-DC;ENST00000495032:HOTAIRM1）的表達(dá)水平進(jìn)行初步驗證。
　　第三階段：大樣本獨立驗證，另收集240例SLE患者和120例正常對照的血漿標(biāo)本，隨機(jī)分為訓(xùn)練組（SLE患者160例，正常對照80例）和

8、測試組（SLE患者80例，正常對照40例）。
　　首先，在訓(xùn)練組中，采用qRT-PCR技術(shù)檢測從小樣本初步驗證中得到的差異lncRNAs；然后，在測試組中，應(yīng)用 qRT-PCR技術(shù)對從訓(xùn)練組中驗證出的差異lncRNAs給予進(jìn)一步驗證；最后，在240例SLE患者中，探討最終驗證出的差異lncRNAs與主要臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性。
　　此外，為了評價血漿差異lncRNAs單個或組合作為SLE生物標(biāo)志物的價值，我們首先采用受試者工作特征

9、（receiver operating characteristic, ROC）曲線分析各單個差異lncRNAs的診斷價值，然后基于訓(xùn)練組，應(yīng)用logistic回歸分析構(gòu)建預(yù)測SLE風(fēng)險的lncRNAs聯(lián)合判別模型，并在訓(xùn)練組和測試組中，采用ROC曲線分析探討其聯(lián)合診斷價值。
　　最后，我們在240例SLE患者中，按照有無腎炎將SLE患者分為LN組和SLE非腎炎組，應(yīng)用logistic回歸分析構(gòu)建預(yù)測LN風(fēng)險的lncRNAs聯(lián)合判

10、別模型，采用ROC曲線分析探討血漿差異lncRNAs單個或組合作為鑒別LN和SLE非腎炎生物標(biāo)志物的價值。
　　第四階段：應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測差異lncRNAs在疾病對照組（類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）患者30例，原發(fā)性干燥綜合征（primary Sjogren's syndrome, pSS）患者31例）血漿中的表達(dá)情況，評估差異lncRNAs作為SLE生物標(biāo)志物的特異性，并采用ROC曲

11、線分析對聯(lián)合判別模型的診斷價值給予進(jìn)一步驗證。
　　第二部分：SLE相關(guān)mRNAs及l(fā)ncRNAs的生物信息學(xué)研究
　　對lncRNA芯片建立的 SLE患者血漿 mRNA差異表達(dá)譜，進(jìn)行基因本體論（gene ontology, GO）和 KEGG生物學(xué)途徑（Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway）分析；同時結(jié)合qRT-PCR驗證結(jié)果，建立差異lncRNA-mRNA共表達(dá)

12、網(wǎng)絡(luò)分析；采用競爭性內(nèi)源RNA（competitive endogenous RNA, ceRNA）分析，構(gòu)建mRNA-miRNA-lncRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探尋可作為ceRNA的lncRNA。
　　結(jié)果：
　　第一部分：SLE患者血漿差異lncRNAs的篩選、驗證及作為生物標(biāo)志物的價值
　　本研究通過lncRNA芯片建立了SLE非腎炎和LN的血漿lncRNA和mRNA差異表達(dá)譜（差異倍數(shù)≥2倍，P≤0.05），從中篩選出

13、10個候選血漿差異表達(dá)lncRNAs，并結(jié)合文獻(xiàn)挑選的5個候選lncRNAs進(jìn)行小樣本初步驗證。
　　小樣本初步驗證發(fā)現(xiàn)，與正常對照相比，在SLE患者血漿中15個候選lncRNAs（ENST00000450640: lnc0640; ENST00000583643: lnc3643; ENST00000584688:lnc4688; ENST00000425150: lnc5150; ENST00000506655: lnc665

14、5; NR_027074:lnc7074;ENST00000507514:lnc7514;ENST00000458228:lnc8228;ENST00000519603:lnc9603;uc001agf.1:lncagf.1;GAS5;linc0597;linc0949;lnc-DC;HOTAIRM1）中共有9個 lncRNAs（GAS5, linc0597, lnc0640, lnc5150, lnc3643, lnc6655, ln

15、c7074, lnc7514, lncagf.1）的表達(dá)水平存在顯著變化（均有P<0.05）。
　　大樣本獨立驗證進(jìn)一步確定了在訓(xùn)練組和測試組的血漿樣本中，linc0597、GAS5、lnc0640、lnc5150和lnc7074的表達(dá)水平均顯著變化（均有P<0.05）。且在訓(xùn)練組和測試組中，LN患者與SLE非腎炎患者比較，lnc7074、lnc3643、lnc0640、lnc7514和lnc6655的表達(dá)水平均顯著上調(diào)（均有P<

16、0.05）。
　　關(guān)聯(lián)性研究結(jié)果顯示血漿linc0597和GAS5的表達(dá)水平與C3水平均呈顯著負(fù)相關(guān)（分別為P<0.001和P=0.009）；lnc5150的表達(dá)水平與血小板減少和C3水平顯著相關(guān)（分別為P=0.008和P=0.001）；lnc0640的表達(dá)水平與低補(bǔ)體、血小板減少和C3水平顯著相關(guān)（分別為P=0.001、P=0.017和P<0.001）；lnc7074的表達(dá)水平與血小板減少和C3水平顯著相關(guān)（分別為P=0.028

17、和P<0.001）。
　　在訓(xùn)練組中，血漿 linc0597、GAS5、lnc0640、lnc5150和 lnc7074作為 SLE生物標(biāo)志物的ROC曲線下面積（area under the curve, AUC）分別為0.634、0.824、0.598、0.625和0.602，5個lncRNAs組合預(yù)測SLE風(fēng)險的判別公式為logit(P=SLE)=?2.594+7.503× linc0597?14.253× GAS5+2.85

18、3× lnc5150?7.012× lnc7074+6.233× lnc0640，AUC為0.966。在測試組中，血漿linc0597、GAS5、lnc0640、lnc5150和lnc7074作為SLE生物標(biāo)志物的AUC分別為0.649、0.851、0.615、0.683和0.662，聯(lián)合判別模型的AUC為0.968。
　　與測試組SLE患者相比，在RA患者的血漿中，GAS5和linc0597的表達(dá)水平均顯著上調(diào)（均有P<0.05

19、）；在pSS患者的血漿中，GAS5和lnc7074的表達(dá)水平均顯著上調(diào)（均有P<0.05）。在測試組SLE患者和RA患者中，聯(lián)合判別模型的AUC為0.683；在測試組SLE患者和pSS患者中，聯(lián)合判別模型的AUC為0.910；在測試組SLE患者和RA患者+pSS患者中，聯(lián)合判別模型的AUC為0.798。
　　在240例SLE患者中，腎炎組和非腎炎組相比，血漿lnc0640、lnc3643、lnc5150、lnc6655、lnc70

20、74和lnc7514的表達(dá)水平均顯著上調(diào)（均有P<0.05）。lnc0640、lnc3643、lnc5150、lnc6655、lnc7074和lnc7514用于鑒別LN和SLE非腎炎的AUC分別為0.644、0.671、0.601、0.631、0.665和0.684；lnc3643、lnc5150和lnc7514可聯(lián)合作為鑒別LN和SLE非腎炎的生物標(biāo)志物，3個lncRNAs預(yù)測LN風(fēng)險的聯(lián)合判別公式為logit(P=LN)=?0.13

21、9+1.387× lnc3643?2.048× lnc5150+1.647× lnc7514，AUC為0.716。
　　第二部分：SLE相關(guān)mRNAs及l(fā)ncRNAs的生物信息學(xué)研究
　　GO分析結(jié)果顯示，在SLE患者下調(diào)的血漿mRNAs中，“ion homeostasis”、“cation transmembrane transporter activity”和“plasma membrane part”分別在生物過程（b

22、iological process, BP）、分子功能（molecular function, MF）和細(xì)胞組分（cellular component, CC）中富集程度最高；在SLE患者上調(diào)的血漿mRNAs中，“cell-cell signaling”、“anion:cation symporter activity”和“cell periphery”分別在BP、MF和CC中富集程度最高。
　　KEGG Pathway分析結(jié)果顯

23、示，在 SLE患者下調(diào)的血漿 mRNAs中，“axon guidance- Homo sapiens(human)”通路富集程度最高；在 SLE患者上調(diào)的血漿mRNAs中，“MAPK signaling pathway-Homo sapiens(human)”通路富集程度最高。
　　LncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，GAS5、lnc0640、lnc5150、lnc7074、lnc3643、lnc6655和lnc7514

24、分別與174、18、48、30、36、28和20個mRNAs有較一致的表達(dá)模式（Pearson相關(guān)系數(shù)≥0.935）。其中，DUSP4（dual specificity phosphatase4）、ARRB2（arrestin beta2）和RPS6KA5（ribosomal protein S6 kinase A5）可能分別是 GAS5、lnc0640和 lnc5150正向調(diào)控的靶基因，GAS5、lnc0640和lnc5150可能均通

25、過MAPK通路參與SLE的發(fā)病過程；C4orf26（chromosome4 open reading frame26）可能為lnc0640、lnc5150、lnc6655和lnc7074共同作用的靶基因；PARP16（poly(ADP-ribose) polymerase family member16）可能為lnc3643、lnc5150、lnc6655和lnc7074共同作用的靶基因。
　　CeRNA分析結(jié)果顯示，GAS5、l

26、nc0640、lnc3643、lnc6655和lnc7074可作為ceRNA與預(yù)測靶基因競爭靶向miRNAs，進(jìn)而影響靶向miRNAs對其預(yù)測靶基因的調(diào)控。
　　結(jié)論：
　　1.與正常對照相比，SLE患者血漿中GAS5和lnc7074表達(dá)水平顯著下調(diào)，linc0597、lnc0640和lnc5150表達(dá)水平顯著上調(diào)；SLE患者血漿中l(wèi)inc0597和GAS5的表達(dá)水平顯著低于RA患者，GAS5和lnc7074的表達(dá)水平顯著低

27、于pSS患者；
　　2.血漿linc0597、GAS5、lnc0640、lnc5150和lnc7074聯(lián)合有望作為SLE潛在的生物標(biāo)志物；lnc3643、lnc5150和lnc7514聯(lián)合有望作為鑒別LN和SLE非腎炎潛在的生物標(biāo)志物；
　　3. GAS5、lnc0640和lnc5150可能通過MAPK通路參與SLE的發(fā)病過程；
　　4. GAS5、lnc0640、lnc3643、lnc6655和lnc7074可能作為