鋅指蛋白36與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)性的分子流行病學(xué)研究.pdf

1、研究背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic Lupus Erythematosus, SLE）是一種慢性自身免疫性疾病，對(duì)機(jī)體多器官、多系統(tǒng)產(chǎn)生損害，患者臨床表現(xiàn)復(fù)雜，主要特征包括多種自身抗體產(chǎn)生、補(bǔ)體激活、免疫復(fù)合物沉積。其病因和發(fā)病機(jī)制目前仍未被完全闡明，大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，遺傳、環(huán)境和內(nèi)分泌等因素之間的相互作用引起機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂，最終導(dǎo)致SLE的發(fā)生。
　　信使RNA(Messenger RNA，mRNA)衰變是控

2、制許多炎癥相關(guān)基因表達(dá)的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制。既往研究指出，多種與炎癥有關(guān)的基因mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）富含AU重復(fù)序列（AU-rich element, ARE）。細(xì)胞中存在一類蛋白與mRNA有高度親和性，可以通過與ARE結(jié)合從而調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，這類蛋白被稱為RNA結(jié)合蛋白。鋅指蛋白36（Tristetraprolin, TTP）是最常見的一種RNA結(jié)合蛋白，又名ZFP36，TIS

3、11，NUP475，GOS24。研究表明，TTP可以與多種靶基因mRNA的ARE結(jié)合，調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)的表達(dá)，如腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）、白細(xì)胞介素6（Interleukin6, IL-6）和IL-10等。有研究發(fā)現(xiàn)TTP可通過阻滯核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factorκB, NF-κB)/p65細(xì)胞核移位從而抑制NF-κB的活性。還有研究表明TTP與組蛋白

4、去乙?；福℉istone deacetylases, HDACs）間的相互作用，能夠負(fù)向調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路。上述研究表明TTP不僅能夠通過導(dǎo)致mRNA衰變來調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，而且在炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面也具有潛在的調(diào)節(jié)作用。
　　輔助性T細(xì)胞17(Th17)是新近發(fā)現(xiàn)的一種Th細(xì)胞亞型，以分泌IL-17為主，因此命名為Th17細(xì)胞。除分泌IL-17外，Th17還可分泌IL-21、IL-22等細(xì)胞因子。大量研究表明，Th1

5、7細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子參與了SLE的發(fā)病。TTP敲除小鼠的骨髓誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞（Bone marrow-induced dendritic cells, BMDCs）中，IL-17、IL-23p19和IL-23表達(dá)顯著升高；在皮膚和淋巴結(jié)中，IL-17、IL-22、IL-23p19的表達(dá)顯著升高，CD4+IL-17+T細(xì)胞和CD4+IL-22+T細(xì)胞百分比也顯著升高。此外，TTP敲除小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的炎癥性表現(xiàn)，如關(guān)節(jié)炎、皮炎。該研究提示

6、TTP能促進(jìn)IL-23p19 mRNA的降解進(jìn)而調(diào)節(jié)IL-23的產(chǎn)生，且TTP敲除小鼠表現(xiàn)出的臨床和免疫學(xué)異常與IL-23/Th17軸有關(guān)。人T細(xì)胞株HuT102轉(zhuǎn)入TTP后，IL-17表達(dá)顯著下調(diào)，相反，Jurkat細(xì)胞株轉(zhuǎn)入TTP-siRNA后，IL-17表達(dá)上調(diào)。此外，研究發(fā)現(xiàn)TTP能夠直接結(jié)合到IL-17和IL-22 mRNA的ARE位點(diǎn)，破壞mRNA的穩(wěn)定性，從而介導(dǎo)IL-17和IL-22表達(dá)下調(diào)。TTP缺陷小鼠出現(xiàn)不完整脫發(fā)

7、、關(guān)節(jié)炎、皮炎、結(jié)膜炎，腎小球系膜增厚等癥狀，同時(shí)抗核抗體（Antinuclear antibody，ANA）、抗單鏈DNA（Single strain DNA，ssDNA）抗體、抗雙鏈DNA（Double strain DNA，dsDNA）抗體在TTP缺陷小鼠血清中升高。一項(xiàng)針對(duì)NZB/W型狼瘡鼠來源的腎小球系膜細(xì)胞的研究表明，調(diào)節(jié)TTP的表達(dá)可能對(duì)IL-6的產(chǎn)生和SLE腎小球系膜細(xì)胞增生具有潛在影響。
　　大量研究表明，TTP

8、在癌癥、感染、代謝綜合征等炎癥性疾病的發(fā)展過程中起重要作用。而針對(duì)TTP在自身免疫性疾病中所起的作用的研究較少。已有文獻(xiàn)報(bào)道TTP與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）發(fā)病和嚴(yán)重程度相關(guān)。它是否也參與SLE的發(fā)病尚不清楚。因此，鑒于以上理論基礎(chǔ)，本研究擬開展TTP與SLE發(fā)病相關(guān)性的分子流行病學(xué)研究。收集 SLE患者和正常對(duì)照，采用 TaqMan基因分型方法，分析TTP基因多態(tài)性與SLE遺傳易感性的關(guān)系；采用實(shí)

9、時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)技術(shù)，檢測SLE患者與正常對(duì)照、活動(dòng)期SLE患者與非活動(dòng)期SLE患者、狼瘡腎炎（Lupus nephritis，LN）患者與非腎炎患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC）中TTP基因mRNA表達(dá)水平的差異，并分析TTP基因mRNA表達(dá)水平與

10、SLE疾病活動(dòng)度、臨床特征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)聯(lián)。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測SLE患者血漿中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和 IL-23的表達(dá)水平，并分析 PBMC中 TTP基因 mRNA表達(dá)水平與血漿 TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23水平的關(guān)聯(lián)；采用蛋白質(zhì)印跡法（Wester

11、n blot）檢測SLE患者與正常對(duì)照、LN患者與非LN患者、活動(dòng)期SLE患者與非活動(dòng)期SLE患者的外周血CD4+T細(xì)胞中TTP蛋白表達(dá)水平的差異，分析TTP蛋白表達(dá)水平與SLE疾病活動(dòng)度、臨床特征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)情況，以期為發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物提供參考，進(jìn)而為SLE的診斷和臨床治療提供依據(jù)。本研究分為三個(gè)部分。
　　第一部分：TTP基因多態(tài)性與SLE遺傳易感性的相關(guān)性研究
　　目的：比較SLE患者和正常對(duì)照之間，LN患

12、者與非LN患者之間TTP基因（rs251864和rs3746083）的等位基因和基因型頻率分布間的差異，探討TTP基因多態(tài)性與中國漢族人群SLE遺傳易感性關(guān)聯(lián)。并結(jié)合臨床資料，探討 TTP基因（rs251864和rs3746083）與臨床表現(xiàn)間的關(guān)系。
　　方法：本次研究共收集SLE患者1167例，患者全部來源于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和安徽省立醫(yī)院風(fēng)濕免疫科。所有患者均符合1997年美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)（American Colleg

13、e Rheumatology，ACR）修訂的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)。1194例正常對(duì)照來自兩所三甲醫(yī)院健康體檢中心以及安徽醫(yī)科大學(xué)在校學(xué)生。經(jīng)研究對(duì)象知情同意后，抽取5ml外周靜脈血，收集 SLE患者的一般情況和主要臨床特征資料，并提取 DNA，采用 TaqMan技術(shù)進(jìn)行基因分型。統(tǒng)計(jì)分析采用 SPSS19.0軟件。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：（1）哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)檢驗(yàn)

14、 TTP基因rs251864和rs3746083兩個(gè)位點(diǎn)的基因型分布在病例組和對(duì)照組中均達(dá)到遺傳平衡（P>0.05）。
　　（2）TTP基因 rs251864位點(diǎn)多態(tài)性與 SLE的關(guān)聯(lián)性研究 rs251864位點(diǎn)等位基因頻率在病例組和對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（G vs. A:χ2=1.091, P=0.296）?；蛐皖l率在病例組和對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（GG vs. AA:χ2=1.077, P=0.299,OR=1.188,

15、95%CI:0.8580-1.646; AG vs. AA:χ2=0.007, P=0.931, OR=0.992,95%CI:0.833-1.182）。此外，顯性模型和隱性模型的病例組和對(duì)照組分布也均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（GG+GA vs. AA:χ2=0.124, P=0.725, OR=1.030,95%CI:0.873-1.216;GG vs. GA+AA:χ2=1.175, P=0.278, OR=1.192,95%CI:0.86

16、8-1.638）。LN患者與非LN患者等位基因和基因型頻率分布間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果顯示 rs251864位點(diǎn)與口腔潰瘍存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)（χ2=4.367, P=0.037）。
　?。?）TTP基因 rs3746083位點(diǎn)多態(tài)性與 SLE的關(guān)聯(lián)性研究 rs3746083位點(diǎn)T等位基因在病例組中有降低的趨勢，但差異并未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T vs. C:χ2=3.310, P=0.069, OR=0.749,95%C

17、I:0.548-1.024）?；蛐皖l率在病例組和對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（TT vs. CC:χ2=0.013, P=0.908, OR=1.093,95%CI:0.241-4.963;CT vs. CC:χ2=2.761, P=0.097, OR=1.335,95%CI:0.949-1.878）。無論是顯性模型還是隱性模型，病例組與對(duì)照組間分布均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（TT+TC vs. CC:χ2=2.940, P=0.086, OR=

18、1.337,95%CI:0.959-1.865;TT vs. TC+CC:χ2=0.008, P=0.929, OR=1.071,95%CI:0.234-4.899）。LN患者與非LN患者等位基因和基因型頻率分布間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果顯示 rs3746083位點(diǎn)與SLE主要臨床特征之間沒有關(guān)聯(lián)（P>0.05）。
　　結(jié)論：本研究表明在中國漢族人群中TTP基因rs251864和rs3746083位點(diǎn)多態(tài)性與SL

19、E的易感性無關(guān)，rs251864位點(diǎn)多態(tài)性可能與SLE患者合并口腔潰瘍有關(guān)。
　　第二部分：SLE患者PBMC中TTP基因mRNA表達(dá)水平及其與血漿TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23細(xì)胞因子的關(guān)聯(lián)性研究
　　目的：比較SLE患者與正常對(duì)照、LN患者與非LN患者、活動(dòng)期SLE患者與非活動(dòng)期SLE患者的 PBMC中TTP基因mRNA表達(dá)水平及與血漿中TNF-α、IL-6、IL-10、

20、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23的關(guān)聯(lián)性。
　　方法：42例 SLE患者來源于研究一。40例正常對(duì)照來源于合肥市中心血站健康獻(xiàn)血者和安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)生。采用現(xiàn)有資料和問卷調(diào)查相結(jié)合的方法收集SLE患者和正常對(duì)照相關(guān)信息，進(jìn)行SLE疾病活動(dòng)指數(shù)（SLE disease activity index, SLEDAI）評(píng)分，并抽取5 ml外周靜脈血，利用密度梯度離心法分離PBMC。利用trizol提取PBMC中的RNA。RT

21、-PCR方法檢測42例SLE患者和40例健康對(duì)照PBMC中TTP基因mRNA表達(dá)水平。ELISA方法檢測42例SLE患者血漿中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23的水平。采用 SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：（1）各組間PBMC中 TTP基因mRNA表達(dá)水平比較： SLE患者與正常對(duì)照PBMC中TTP基因mRNA表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Z=-1.299,

22、 P=0.194），活動(dòng)期SLE患者PBMC中TTP基因mRNA表達(dá)水平與非活動(dòng)期SLE患者相比有降低的趨勢，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.693, P=0.090），LN患者PBMC中TTP基因mRNA表達(dá)水平低于非LN患者（Z=-2.695, P=0.007）。
　?。?）SLE患者 PBMC中 TTP基因mRNA表達(dá)水平與主要臨床特征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系：SLE患者 PBMC中 TTP基因mRNA表達(dá)水平與蛋白尿和抗-dsD

23、NA抗體有關(guān)（Z=-2.323, P=0.020;Z=-2.299, P=0.022）。
　　（3）SLE患者 PBMC中 TTP基因 mRNA表達(dá)水平與 SLEDAI相關(guān)性分析：Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，SLE患者 PBMC中 TTP基因mRNA水平與SLEDAI評(píng)分有負(fù)相關(guān)趨勢，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（rs=-0.293, P=0.060）。
　　（4）SLE患者各組間血漿TNF-α、IL-6、IL-10、IL

24、-17、IL-21、IL-22和IL-23的水平比較：LN患者與非LN患者血漿IL-17差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.132，P=0.039），未發(fā)現(xiàn)疾病活動(dòng)組與非活動(dòng)組間TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23表達(dá)水平的差異（P>0.05）。
　?。?）SLE患者血漿TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23的水平與主要臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)的關(guān)聯(lián)：研究

25、發(fā)現(xiàn)在有胸膜炎的SLE患者血漿中TNF-α和IL-17水平顯著升高（t=2.346, P=0.024;t=2.102, P=0.042），在白細(xì)胞降低的SLE患者血漿中TNF-α、IL-17、IL-21和IL-22水平顯著升高（t=2.314, P=0.026;t=2.232, P=0.031;t=3.140, P=0.003;t=2.229, P=0.031），未發(fā)現(xiàn)血漿IL-6、IL-10和IL-23水平與SLE患者的臨床和實(shí)驗(yàn)室特

26、征之間存在關(guān)聯(lián)（P>0.05）。
　?。?）SLE患者血漿TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23的水平與SLEDAI相關(guān)性分析：SLE患者血漿中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23水平與 SLEDAI評(píng)分之間無明顯相關(guān)性（P>0.05）。
　?。?）SLE患者PBMC中TTP基因mRNA表達(dá)水平與血漿中TNF-α、IL-6、IL-10、IL

27、-17、IL-21、IL-22和IL-23水平的相關(guān)性：SLE患者中TTP基因mRNA表達(dá)水平與血漿TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.316, P=0.042），與血漿IL-17水平呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.338, P=0.029），未發(fā)現(xiàn)SLE患者TTP基因mRNA表達(dá)水平與IL-6、IL-10、IL-21、IL-22和IL-23水平的相關(guān)性（P>0.05）。
　?。?）TTP基因多態(tài)性與TTP基因mRNA水平的關(guān)系：未發(fā)現(xiàn)rs

28、251864、rs3746083與TTP的mRNA表達(dá)水平之間的關(guān)聯(lián)（P>0.05）。
　　結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)SLE患者與正常對(duì)照PBMC中TTP mRNA表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，活動(dòng)期SLE患者與非活動(dòng)期SLE患者相比TTP mRNA表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，SLE合并LN患者PBMC中TTP基因mRNA表達(dá)水平低于非LN患者。SLE患者 TTP基因 mRNA表達(dá)水平與蛋白尿和抗 dsDNA抗體陽性有關(guān)。SLE患者TTP基因 mRNA表

29、達(dá)水平與血漿TNF-α、IL-17水平呈負(fù)相關(guān)。SLEDAI評(píng)分與TTP基因mRNA表達(dá)水平無明顯相關(guān)性。未發(fā)現(xiàn)TTP基因rs251864、rs3746083位點(diǎn)多態(tài)性與mRNA水平的關(guān)聯(lián)。
　　第三部分：SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞中TTP表達(dá)水平與SLE的相關(guān)性研究
　　目的：比較SLE患者與正常對(duì)照、LN患者與非LN患者以及活動(dòng)期SLE患者與非活動(dòng)期SLE患者的外周血CD4+T細(xì)胞中TTP蛋白表達(dá)水平，分析其與SLE

30、患者疾病活動(dòng)度、臨床特征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)。
　　方法：25例SLE患者來自安徽省立醫(yī)院和安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科。SLE患者均符合1997年ACR修訂的 SLE分類標(biāo)準(zhǔn)。23例正常對(duì)照來自安徽醫(yī)科大學(xué)教職工和學(xué)生。經(jīng)研究對(duì)象知情同意后，抽取20ml外周靜脈血，收集其一般情況資料和臨床實(shí)驗(yàn)室資料，并進(jìn)行 SLEDAI評(píng)分。利用密度梯度離心法分離PBMC，并應(yīng)用免疫磁珠法進(jìn)一步分選出 CD4+T淋巴細(xì)胞，然后應(yīng)用流式細(xì)

31、胞術(shù)檢測免疫磁珠法分選前后CD4+T淋巴細(xì)胞的純度，接著應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測CD4+T淋巴細(xì)胞中TTP的蛋白表達(dá)情況。采用 SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，與分選前的純度相比，應(yīng)用免疫磁珠法分選后的CD4+T淋巴細(xì)胞純度高達(dá)95%以上。
　?。?）CD+T細(xì)胞中TTP蛋白表達(dá)水平比較： SLE患者與正常對(duì)照之間CD4+T細(xì)胞中TTP蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)

32、意義(Z=-1.249, P=0.212)，活動(dòng)期SLE患者與非活動(dòng)期SLE患者、LN患者與非LN患者相比外周血CD4+T細(xì)胞中TTP蛋白表達(dá)水平均有降低的趨勢，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.654, P=0.098; Z=-1.689, P=0.091）。
　?。?）CD+T細(xì)胞中TTP蛋白表達(dá)水平與主要臨床特征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系：分析結(jié)果顯示，TTP蛋白表達(dá)水平與發(fā)熱有關(guān)（Z=-2.272, P=0.023）。未發(fā)現(xiàn)TTP蛋

33、白表達(dá)水平與其他臨床特征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)。
　?。?）CD+T細(xì)胞中TTP蛋白表達(dá)水平與SLEDAI相關(guān)性分析：Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，SLE患者 PBMC中 TTP蛋白表達(dá)水平與 SLEDAI評(píng)分之間無相關(guān)性（rs=-0.132, P=0.528）。
　　結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)SLE患者與正常對(duì)照、活動(dòng)期SLE患者與非活動(dòng)期SLE患者、LN患者與非LN患者之間外周血CD4+T細(xì)胞中TTP蛋白表達(dá)水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)