低氧誘導(dǎo)因子1α與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)性的分子流行病學(xué)研究.pdf

1、研究背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)是一種侵犯皮膚及多器官、臨床表現(xiàn)復(fù)雜、病程遷延反復(fù)的自身免疫性疾病,對(duì)患者的身心健康造成較大危害,已經(jīng)成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。近年來(lái),SLE病因?qū)W研究發(fā)展迅速,在免疫、遺傳、流行病學(xué)等領(lǐng)域均取得了一定進(jìn)展。已有研究表明,輔助性T細(xì)胞(Helper T Cell,Th)在SLE及其它自身免疫疾病的發(fā)病中起重要作用,活化的自身反應(yīng)性T

2、h細(xì)胞促使B細(xì)胞分化、產(chǎn)生自身抗體,包含自身抗體的免疫復(fù)合物和炎性Th細(xì)胞因子導(dǎo)致組織和器官損傷。
　　低氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-Inducible Factor1,HIF-1)是一種異二聚體轉(zhuǎn)錄因子,1992年由美國(guó)Semenza等人首先發(fā)現(xiàn),它由亞單位HIF-1α和HIF-1β組成。HIF-1α廣泛表達(dá)于各種組織,既是 HIF-1的調(diào)節(jié)亞基又是活性亞基,因此 HIF-1的生物效應(yīng)是由α亞基實(shí)現(xiàn)的。表達(dá)于T細(xì)胞中的HIF

3、-1α,在低氧或非低氧的刺激下,均可以促進(jìn)其 mRNA表達(dá)的增加。已有證據(jù)顯示,在炎癥反應(yīng)過(guò)程中,機(jī)體常需要“激活”HIF-1,以應(yīng)對(duì)炎癥過(guò)程中的低氧,而HIF-1本身也可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞而驅(qū)動(dòng)炎癥反應(yīng)。在癌癥、炎性腸炎和感染等炎癥性疾病的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)過(guò)程中,HIF-1均扮演了至關(guān)重要的角色。
　　近年來(lái)本課題組和國(guó)內(nèi)外的研究均發(fā)現(xiàn),Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子參與了SLE的發(fā)病。與Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相對(duì)應(yīng),調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(

4、Regulatory T Cells,Tregs)則在維持外周耐受,壓制自身反應(yīng)性T細(xì)胞活性等免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中扮演了至關(guān)重要的角色。在正常情況下Treg細(xì)胞和Thl7細(xì)胞的效應(yīng)處于一種平衡狀態(tài),Treg/Thl7平衡失調(diào)在組織炎癥和自身免疫性疾病等疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。同時(shí),SLE患者體內(nèi)的調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞也存在著功能和數(shù)量上的異常?；罨腡h17和缺陷的Tregs在SLE發(fā)病過(guò)程中起著重要作用。
　　最近研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α

5、能激活RORγt(Retinoid-related Orphan Nuclear Receptorγt,維甲酸相關(guān)孤核受體γt)的轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)Th17的增殖,并且可與RORγt、p300共同作用上調(diào)IL-17A基因表達(dá);同時(shí),HIF-1α通過(guò)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3(foxhead box protein3,叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子P3)降解而抑制Treg細(xì)胞的發(fā)育。這些研究提示Th17/Tregs分化平衡依賴(lài)于HIF-1α;阻斷HIF-1α有可

6、能減緩Th17細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。
　　表達(dá)/功能異常的HIF-1α是否可通過(guò)影響Th17/Tregs的平衡,導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的表達(dá)紊亂從而參與SLE的發(fā)病等問(wèn)題尚有待于進(jìn)一步探討。在中國(guó)漢族人群尚無(wú)HIF-1α與SLE的關(guān)聯(lián)研究。
　　因此,本研究擬開(kāi)展HIF-1α與 SLE發(fā)病相關(guān)性的分子流行病學(xué)研究擬收集SLE患者和健康對(duì)照樣本,應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默HIF-1基因,檢測(cè)HIF-1基因Knockdown對(duì)SLE患

7、者體內(nèi)PBMC中細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,初步探討HIF-1基因功能;采用ELISA等技術(shù),檢測(cè)SLE患者與對(duì)照血清中HIF-1α表達(dá)水平的差異,并分析其與SLE疾病活動(dòng)度、臨床亞型的關(guān)聯(lián);通過(guò)Sequenom MassARRAY方法,分析HIF-1α基因多態(tài)性與SLE遺傳易感性的關(guān)系,并進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證。本研究分為三個(gè)部分。
　　第一部分：RNA干擾體外沉默SLE患者PBMC中HIF-1的影響及相關(guān)機(jī)制研究
　　目的：利用RNA

8、干擾技術(shù),構(gòu)建HIF-1α-shRNA慢病毒載體,沉默SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中HIF-1基因表達(dá),觀察沉默效率并研究沉默后相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平變化,初步探索系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者HIF-1的基因功能。
　　方法：收集SLE確診且新發(fā)病例5例,患者符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1997年修訂的SLE分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。采集研究對(duì)象外周血各40ml,分離 PBMC。利用 RNA干擾沉默 HIF-1基因初步研究其基因功能,并分析 HIF-lα與

9、IL-17之間的相關(guān)性。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將LV-shRNA-HIF和LV-shRNA-HIF-NC同包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,獲得重組慢病毒。采用慢病毒載體方法將LV-shRNA-HIF慢病毒感染SLE患者PBMC細(xì)胞,采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR,RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)構(gòu)建成功的RNAi表達(dá)載體在mRNA及蛋白水平對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)的抑制,同時(shí)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(

10、ELISA)法檢測(cè) HIF-1α和IL-17在培養(yǎng)上清中的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：(1)實(shí)驗(yàn)組HIF-1沉默效率可達(dá)95％;(2)RT-PCR可見(jiàn),實(shí)驗(yàn)組HIF-1基因mRNA表達(dá)豐度顯著低于對(duì)照組(p<0.05);(3)Western blot可見(jiàn),實(shí)驗(yàn)組HIF-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(p<0.05);(3)實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)上清中HIF-1α濃度顯著低于對(duì)照組(p<0.001);(4)實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)上清中IL-17濃度顯著低于對(duì)照組(p<0

11、.001);(5)實(shí)驗(yàn)組HIF-1α與IL-17顯著正相關(guān)(r=0.959,p<0.001)。
　　結(jié)論：構(gòu)建成功的RNAi表達(dá)載體可以有效抑制目標(biāo)基因HIF-1在mRNA及蛋白水平的表達(dá),沉默HIF-1基因后HIF-1α與IL-17表達(dá)水平顯著正相關(guān)。
　　第二部分：HIF-1α血清學(xué)表達(dá)水平與SLE的相關(guān)性研究
　　目的：比較SLE患者與正常對(duì)照、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、原發(fā)性干燥綜合癥(pSS)和系統(tǒng)性硬化癥(S

12、Sc)之間;狼瘡腎炎(LN)患者和SLE未并發(fā)腎炎患者之間;SLE患者有無(wú)某臨床癥狀之間以及活動(dòng)期 SLE患者和非活動(dòng)期 SLE患者之間HIF-1α血清學(xué)水平的差異,探討HIF-1α水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)度、IL-17水平的關(guān)聯(lián)。
　　方法：收集149例確診的SLE患者,102例健康對(duì)照者,疾病對(duì)照組由三種常見(jiàn)自身免疫疾病患者組成:46例RA患者;50例pSS患者和26例SSc患者。在獲取研究對(duì)象知情同意后采用自行設(shè)計(jì)的問(wèn)卷

13、進(jìn)行調(diào)查,同時(shí)抽取5ml非抗凝外周靜脈血,分離血清,-80℃凍存留待檢測(cè)。采用 ELISA試劑盒檢測(cè)血清 HIF-1α和IL-17水平。數(shù)據(jù)錄入采用Excel2007軟件進(jìn)行,統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS10.01軟件進(jìn)行。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較符合正態(tài)分布且方差齊性者采用t檢驗(yàn),兩組間定量資料相關(guān)性分析采用 Pearson相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：(1)各組人口學(xué)資料分析149例S

14、LE患者被納入分析,其中141例女性,8例男性,年齡分布從9歲到65歲(32.5±10.9)。患者從出現(xiàn)癥狀到被納入分析的時(shí)間(即采集血液并收集信息的時(shí)間)被定義為病程,從0到19.3年(3.7±4.2)。SLE患者的疾病活動(dòng)度評(píng)分從1到44(12.0±7.9),81例患者為活動(dòng)期病人,約占54.4%。(2)各組HIF-1α水平比較 SLE患者血清HIF-1α水平為32.76±12.60 pg/ml,健康對(duì)照組為23.04±11.35

15、pg/ml,RA患者組為28.71±10.88 pg/ml,pSS患者組為30.08±23.57 pg/ml,SSc患者組為26.15±13.92 pg/ml。兩兩比較分析發(fā)現(xiàn),SLE組與健康對(duì)照組、SSc患者組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p值分別為:p<0.0001和p=003);SLE組與RA患者組和pSS患者組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p值分別為:p=0.09和p=0.25)。同時(shí),RA患者組和pSS患者組分別與健康對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.

16、02和p=0.004)。在SLE亞組分析中,SLE合并腎炎組血清HIF-1α水平為35.06±11.64 pg/ml,非腎炎組為32.03±12.86pg/ml,兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.50),但是分別與健康對(duì)照組相比差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值均<0.0001)。SLE活動(dòng)期患者血清HIF-1α水平為34.83±13.94 pg/ml,非活動(dòng)期患者組為30.31±10.38 pg/ml,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.03)。對(duì)各臨床

17、癥狀陽(yáng)性組與陰性組的血清HIF-1α水平進(jìn)行分析,均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值均>0.05)。(3)相關(guān)性分析 HIF-1α水平與 SLE疾病活動(dòng)度評(píng)分(SLEDAI)顯著正相關(guān)(r=0.23;p=0.004)。同時(shí),在SLE患者組,HIF-1α水平與IL-17水平正相關(guān)(r=0.53;p<0.0001),但是未發(fā)現(xiàn)其與SLE的病程之間的相關(guān)性(r=-0.02;p>0.05)。
　　結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)SLE患者與健康對(duì)照組(HC組)、SS

18、c患者組,狼瘡腎炎、非狼瘡腎炎患者與健康對(duì)照組(HC組),SLE患者疾病活動(dòng)組與非疾病活動(dòng)組之間HIF-1α表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,SLE患者與RA、PSS患者,狼瘡腎炎組與非狼瘡腎炎組之間未發(fā)現(xiàn)表達(dá)差異,SLE患者HIF-1α表達(dá)水平與SLEDAI、IL17水平存在相關(guān),但未發(fā)現(xiàn)HIF-1α水平與 SLE患者的部分臨床特征之間存在關(guān)聯(lián)。
　　第三部分HIF-1基因多態(tài)性與SLE遺傳易感性的相關(guān)性研究
　　目的：比較 SLE患

19、者和正常對(duì)照 HIF-1基因(rs11549465、rs12434438、rs1957757、rs1951795和rs7143164)的基因型頻率和等位基因頻率,探討其與中國(guó)漢族人群SLE易感性的關(guān)系,同時(shí)結(jié)合臨床資料分析其與SLE主要臨床特征之間的關(guān)系。
　　方法：病例組共1497例SLE患者,來(lái)自?xún)伤揍t(yī)院的住院和門(mén)診病例,均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1997年修訂的SLE分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn);健康對(duì)照2296例,來(lái)自健康體檢中心和健康獻(xiàn)血者,

20、均排除SLE和其他自身免疫疾病。收集研究對(duì)象的一般情況和病例的相關(guān)臨床資料,采集所有研究對(duì)象的外周靜脈血,提取DNA凍存。利用Sequenom MassARRAY技術(shù),檢測(cè)五個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性;比較 SLE病例組和對(duì)照組中各多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布是否存在差異。采用SPSS10.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：(1)哈德-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium,HWE

21、)檢驗(yàn):5個(gè)位點(diǎn)rs11549465、 rs12434438、rs1957757、rs1951795和rs7143164的基因型分布在對(duì)照組中均達(dá)到遺傳平衡。(2)HIF-1基因分型:五個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在病例組和對(duì)照組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。(3)基因分型與主要臨床特征的關(guān)系:分析 rs11549465,rs12434438,rs1957757,rs1951795和rs7143164多態(tài)性與SLE主要臨床