大鼠腎移植慢性排斥模型中外周血清間α胰蛋白酶抑制劑水平的意義探討.pdf

1、背景與目的：
　　 隨著醫(yī)學技術的不斷進步，在器官移植領域，組織配型技術取得跨越式的發(fā)展及新型免疫抑制劑在臨床中的應用，腎移植術已成為臨床治療終末期腎病的主要方法，且人/腎存活率得到逐年升高，術后早期急性排斥反應發(fā)生率明顯下降，移植腎短期存活率得到顯著提高，但移植腎長期存活仍未得到明顯改善，這其中包含免疫因素和非免疫因素的作用，其中在免疫因素中慢性排斥反應是其影響移植腎長期存活率的主要因素，慢性排斥反應仍然是一個長期困擾移植界的

2、難題，供腎與受者達到完全耐受仍然是一個理想的目標。到目前為止，移植腎病理活檢仍是目前能明確診斷慢性排斥反應的金標準，但鑒于其為有創(chuàng)操作，有導致不同并發(fā)癥的風險，同時由于移植腎活檢標本存在誤差，或缺乏程序性腎活檢的資料，供腎移植前存在組織學損傷和CsA或FK506腎毒性與慢性排斥難以區(qū)別，使慢性排斥反應的診斷更復雜，診斷需要3-5天的時間。因此探討一種敏感特異的非侵襲性檢查方法和客觀指標，對于診斷和預測慢性排斥反應及其轉歸，及早干預病情的

3、發(fā)展，制定個體化免疫抑制方案均具有重要意義。
　　 間α胰蛋白酶抑制劑，inter-alpha-trypsin inhibitors(簡寫成ITI)，是一系列蛋白水解酶抑制劑的統(tǒng)稱，血漿中含量較高，ITI在炎癥、創(chuàng)傷修復、腫瘤轉移等免疫活動中發(fā)揮著重要作用。在膿毒癥、壞死性結腸炎等患者血漿中ITI的含量較正常人明顯下降，且下降幅度與病死率相關。而移植腎慢性排斥反應無論是從組織形態(tài)學還是細胞因子角度分析，均存在炎性細胞浸潤、炎癥因

4、子的釋放，在慢性排斥反應中免疫應答占據非常重要的位置，大量文獻證實ITI可以用于預測體內免疫活動強弱的功能，臨床或動物實驗中，已成為膿毒癥、潰瘍性結腸炎、腫瘤等疾病的一個重要的預測及預后的指標，也有大量事實證明其用于治療疾病上，鑒于ITI能預測體內免疫反應強弱的特性，我們通過檢測慢性排斥反應大鼠血漿中ITI的水平，與正常腎移植組大鼠相比較，來初步探討ITI在大鼠慢性排斥反應中所起的作用。
　　 本實驗的目的就是通過觀察間α胰蛋白

5、酶抑制劑（inter-alpha-trypsin inhibitors，以下簡稱ITI）在腎移植術后慢性排斥反應及正常腎移植大鼠外周血動態(tài)表達情況，并與移植腎病理檢查相比照，就ITI對移植腎慢性排斥反應是否有預測作用展開初步探討和研究。
　　 方法：
　　 1、SD-Wistar大鼠腎移植模型的建立
　　 進行一定時間的預實驗，以熟悉顯微外科技術及能建立穩(wěn)定的腎移植模型，正式實驗階段分別選用SD大鼠和Wistar

6、大鼠作為供體和受體，采用顯微外科手術技術行SD-Wistar左腎原位腎移植術。麻醉后分離供體左腎動脈、靜脈、部分腹主動脈及輸尿管，切取供腎前用4℃乳酸林格氏液(含肝素25U/ml)通過腹主動脈原位灌注供腎至呈均勻土黃色，腎靜脈流出液清亮，切取供腎并置于4℃乳酸林格氏液無菌保存。再離斷受體左腎動脈、靜脈及輸尿管后切除左腎，供、受體左腎動脈、腎靜脈及輸尿管分別行端端吻合。受體右腎不切除,完整保留作為每個移植腎樣本的內參照。慢性排斥反應組受體

7、于術前3天起，即給予腹腔注射環(huán)孢素A微乳化劑2mg/kg，每日1次，以抑制急性排斥反應，而正常腎移植組則給予環(huán)孢素A微乳化劑腹腔注射5mg/kg，每日1次。手術后當天一次性肌注青霉素50mg/kg預防感染。并隨機選取兩組大鼠（各10只）在術后當天取血標本檢測CsA濃度谷值。
　　 2、大鼠腎移植慢性捧斥反應組織病理及Treg細胞檢測
　　 取SD大鼠作為供者，Wistar大鼠作為受體，行SD-Wistar大鼠左腎原位移植

8、。保留受體自身右腎作為每一個移植腎的內對照。所有受體均于術后當天一次性肌肉青霉素50mg/kg預防感染。受者60只，存活57只（此數量包含術前大鼠，非實驗設計死亡的大鼠均依據實驗要求再補充至60只），取腎移植存活受體以及術前大鼠共60只進行隨機實驗分組，分成正常腎移植組（對照組，n=30）、慢性排斥反應組（實驗組，n=30）。實驗組從術前3天起給予環(huán)孢素A(2mg/kg.d，腹腔注射)治療，以抑制急性排斥反應，對照組從術前3天起給予環(huán)孢

9、素A(5mg/kg.d，腹腔注射)治療。移植前供者左腎及受者移植后第4周起陸續(xù)獲取移植腎，并取相應的右腎作為內參照，用10％中性福爾馬林固定，制作石蠟切片，行HE、PASM、Masson染色，行大體觀察及組織病理學檢測。
　　 根據組織病理學變化，取移植腎病理學變化最顯著的階段預先留取的血標本，進行流式細胞儀檢測Treg細胞占淋巴細胞的比例，并進行統(tǒng)計學分析，對慢性排斥反應與Treg細胞的關系作初步的探討。
　　 3、I

10、TI的檢測及初步探討其在大鼠腎移植慢性捧斥反應中的意義
　　 分別取兩組大鼠術前、術后4、6、8、10、12周的血標本（各5只），離心收集血漿標本，制備出血漿蛋白，依次進行下列步驟:分離膠和積層膠，制膠板;蛋白變性:準備蛋白樣本，加入等體積的2×上樣Buffer稀釋，置于沸水中煮10min;加樣:每孔加入20-40μl樣品;電泳:置于電泳槽中電泳45min，恒定電流90mA;取出膠板，用切割刀修好膠;將膠置于轉膜液中浸泡;按順序

11、放好下列物質:黑面→海綿→濾紙→膠→NC膜→濾紙（用吸管趕去氣泡）→海綿;置于轉膜槽中，黑面對黑面，加上冰塊，加入轉膜液;裝好電極，于恒定電壓100V下，90min;麗春紅染膜;用TBST洗去麗春紅;封閉:加入5％脫脂奶粉+TBST，常溫搖床搖1h;回收封閉液，加入一抗;置于4℃搖床搖過夜;回收一抗，TBST洗膜，10min，共3次;加入二抗，常溫搖床搖1h;回收二抗，TBST洗膜，10min，共3次;將膜置于發(fā)光液中浸泡約1min;將

12、膜鋪于曝光盒中，于暗室中曝光，洗膠片。
　　 結果：
　　 1、慢性排斥組術后第1天CsA濃度為101.17±12.17ng/ml;正常腎移植組術后第1天CsA濃度為171.33±18.49ng/ml(F=2.164，P=0.159)。預實驗階段共用80只大鼠，其中SD、Wistar大鼠分別為40只，預實驗階段重點是熟悉顯微技術操作及掌握并能穩(wěn)定制作大鼠腎移植模型，在預實驗階段，腎移植大鼠至少觀察12周，記錄大鼠存活狀況

13、以及各種術后并發(fā)癥發(fā)生情況，經過2個多月的顯微技能及模型制作的訓練，即進入正式實驗階段，為便于分組及考慮到術后大鼠可能因某些不可預測因素致死的原因，適當擴大樣本量（即補充非實驗處理因素所致死亡的大鼠），正式實驗大鼠共60對，其中SD、Wistar大鼠分別為60只，記錄大鼠存活狀況以及各種術后并發(fā)癥發(fā)生情況，（其中死亡大鼠指非按實驗計劃處死的大鼠）。在正式實驗階段，供腎熱缺血時間6S～12S，冷缺血時間50min～80min，供體手術1～

14、1.5h，受體腎移植手術時間1.5～2h。
　　 2、正常腎移植組:肉眼所見移植腎大小適中，外觀飽滿，質韌，腎表面鮮紅，術后各時間點移植腎大小、形態(tài)、質地均無明顯的差別，組織病理學除見紅細胞浸潤外未見其他明顯改變。
　　 移植腎慢性排斥組:移植腎逐漸呈現慢性排斥反應改變，至術后第12周移植腎仍存活，體積較右腎明顯縮小，色澤較蒼白。光鏡下病變進一步加重，除出現彌漫漿細胞、單核細胞、淋巴細胞浸潤外，腎小球基底膜增厚，廣泛的腎

15、小球硬化、萎縮以及間質纖維化、炎癥，腎小管萎縮，小動脈內膜增厚，管腔狹窄甚至完全閉塞，呈典型的慢性排斥病理改變，尤以小動脈內膜纖維樣增厚為其特征性組織學改變。陰性內對照的右腎未出現任何組織學改變。
　　 3、大鼠腎移植術后第12周正常腎移植組與慢性排斥反應組血漿中CD4+CD25+Treg細胞的比例有統(tǒng)計學差異(t=6.155，df=8，P=0.000);CD4+FoxP3+Treg細胞在兩組血漿淋巴細胞中的比例也有顯著差異(t

16、=4.153，df=8，P=0.003)，即正常腎移植組血漿中CD4+CD25+標記的Treg細胞及CD4+FoxP3+標記的Treg細胞均高于慢性排斥反應組。
　　 4、正常腎移植組與慢性排斥反應組血漿中ITI表達量不同(P=0.040)，術前兩組ITI表達量無明顯差異(F=2.486，P=0.154)，術后4、6、8、10、12周ITI表達量均有顯著差異，其中術后4周、6周正常腎移植組ITI表達量低于慢性排斥反應組（F值分別

17、為7.942、19.562，P值分別為0.023、0.002），而從術后8周開始至術后12周，正常腎移植組ITI表達量均高于慢性排斥反應組(F值分別為40.004、26.393、27.883，P值分別為0.000、0.001、0.001);不同時間點所檢測的血漿ITI表達量不同，慢性排斥反應組血漿ITI隨移植術后時間推移表達量逐漸下降(P=0.000)，正常腎移植組術后4周、6周、8周、10周ITI表達量與術前、術后12周均有顯著差異，

18、即低于術前水平，高于術后12周水平（P值均為0.000）;慢性排斥反應組術后4周與術后6周間無顯著差異(P=1.000)，術后8周與術后10周也無差異(P=1.000)，其他各兩組間均存在統(tǒng)計學意義;分組與時間存在著交互效應(P=0.000)，提示術后12周慢性排斥反應組血漿ITI表達量最低。
　　 結論：
　　 1、通過本實驗中的處理方法我們可制作穩(wěn)定的大鼠腎移植慢性排斥反應模型，且病理學提示，大鼠腎移植慢性排斥反應在