桑葉降血糖有效組分的提取分離純化工藝研究.pdf

1、桑葉為?？浦参锷orus alba L.的干燥葉，具有清肝明目、疏風(fēng)清熱之功效。古代有記載?？捎糜谥委熛拾Y，即現(xiàn)代的糖尿病。近年來，桑葉的降血糖活性受到眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注和研究。本課題組前期已對(duì)桑葉中降血糖活性的物質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，其降血糖有效組分主要為多糖、黃酮和生物堿類成分。本論文研究了不同季節(jié)桑葉中1-脫氧野尻霉素(DNJ)、總黃酮、蘆丁和多糖含量的變化規(guī)律。采用現(xiàn)代提取分離技術(shù)對(duì)桑葉總黃酮和生物堿的提取分離純化工藝進(jìn)行研究。

2、運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)對(duì)生物堿部位中的主要成分進(jìn)行了分析。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下：
　　1、建立了DNJ、蘆丁、總黃酮及多糖的含量分析方法。建立了柱前衍生化-高效液相色譜紫外檢測(cè)法分析桑葉中DNJ含量；高效液相色譜紫外檢測(cè)法分析桑葉中蘆丁的含量；紫外分光光度法分析桑葉中總黃酮和多糖的含量。方法快速、靈敏、準(zhǔn)確。
　　系統(tǒng)研究了不同生長(zhǎng)季節(jié)桑葉中DNJ、蘆丁、總黃酮和多糖的含量動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，不同生長(zhǎng)季節(jié)的桑葉中DNJ、蘆丁、總

3、黃酮和多糖的含量均有一定差異，且4種成分的變化趨勢(shì)各有差異。桑葉中DNJ含量在7、8月份最高，達(dá)到0.27％。總黃酮含量變化趨勢(shì)同蘆丁一致，即從4月開始下降，6月下旬后升高，經(jīng)霜后含量顯著升高，11月份含量最高。多糖含量從4月份開始逐漸升高，到10月中旬達(dá)到2.32％，之后持續(xù)下降，尤其是在11月中下旬含量急劇降低。
　　2、研究了桑葉總黃酮的提取分離純化工藝。以桑葉總黃酮得率為指標(biāo)，考察了乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)和

4、料液比對(duì)總黃酮提取效果的影響，優(yōu)選出桑葉總黃酮最佳提取工藝為：20倍生藥量的60％乙醇100℃提取2次，每次2.5h。
　　以樹脂對(duì)總黃酮吸附量為考察指標(biāo)，對(duì)樹脂進(jìn)行篩選，得到樹脂V的吸附性能最優(yōu)。研究了樹脂的靜態(tài)吸附性能，樹脂對(duì)桑葉總黃酮的靜態(tài)吸附容量為18.70mg/g濕樹脂，靜態(tài)解吸率為92.73％。考察了樹脂的動(dòng)態(tài)吸附性能，樹脂的動(dòng)態(tài)吸附容量為16.49 mg/g濕樹脂，動(dòng)態(tài)解析率為92.78％。桑葉總黃酮最佳分離純化工藝

5、為：上樣量1:3(樹脂：生藥量)，樹脂吸附流速6BV/h，乙醇濃度為60％，60％乙醇洗脫體積為3BV。經(jīng)兩步純化后得到總黃酮部位中總黃酮的含量能夠達(dá)到50％以上。
　　3、研究了桑葉生物堿的提取分離純化工藝。采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，以DNJ得率為考察指標(biāo)，優(yōu)選出桑葉生物堿的最佳提取工藝：16倍量蒸餾水100℃提取3次，每次1h。DNJ得率為1.76 mg/g。
　　采用離子交換樹脂對(duì)桑葉中DNJ提取物進(jìn)行分離和純化。確定

6、生物堿最佳純化工藝為：001×7陽(yáng)離子交換樹脂上樣量1:3(樹脂量：生藥量)，樹脂吸附流速3mL/min，氨水濃度0.5mol/L，氨水洗脫體積6倍柱體積(6BV)；201×4陰離子交換樹脂上樣量1:3(樹脂量：生藥量)，樹脂吸附流速4mL/min。通過最佳純化工藝得到DNJ純度大于50％的桑葉總生物堿部位。
　　4、桑葉生物堿部位主要成分分析及總生物堿含量測(cè)定。采用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)對(duì)桑葉總生物堿部位中主要成分進(jìn)行分析

7、，鑒定了6個(gè)主要的活性成分的結(jié)構(gòu)，其中5個(gè)多羥基生物堿：DNJ、fagomine、3-epi-fagomine、DAB、CalystegineB2，1個(gè)多羥基生物堿糖苷：2-O-β-Glc-DAB。
　　柱前衍生化HPLC-UV法測(cè)定桑葉生物堿部位中總生物堿的含量，流動(dòng)相為乙腈-0.1％醋酸(50:50，V/V)，最低檢出限為3.3ng，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=13458X-4708.1(相關(guān)系數(shù)r=0.9999)，線性范圍為31.75～5

8、08μg/mL，平均回收率為98.68％，測(cè)得樣品的總生物堿平均含量為76.87％；柱前衍生化HPLC-FP法測(cè)定桑葉生物堿部位中總生物堿的含量，流動(dòng)相為乙腈－0.1％醋酸(50:50，V/V)，最低檢出限0.4ng，回歸方程為Y=33301X+3312.4(相關(guān)系數(shù)r=0.9999)，線性范圍為31.75-508μg/mL，平均回收率為99.02％，測(cè)得樣品的總生物堿平均含量為76.70％；雷氏鹽比色法測(cè)定桑葉生物堿部位中總生物堿的含