微孔板雜交法對腎綜合征出血熱早期診斷的應用研究.pdf

1、目的：探索建立一種敏感特異的早期診斷腎綜合征出血熱的檢測方法。 方法： 1.從河北省各醫(yī)院采集臨床診斷為腎綜合征出血熱病人的急性期血清，用間接免疫熒光法(IFA)檢測血清中IgG抗體； 2.用間接免疫熒光法檢測到的陽性鼠肺標本經漂洗、研磨、過濾后制成病毒上清； 3.從病毒上清或IFA檢測王HFRS陽性的病人血清中提取漢坦病毒的總RNA，以RNA為模板，參考漢坦病毒的保守序列設計引物并進行逆轉錄獲得相應的c

2、DNA； 4 采用標記有生物素的上游引物經套式PCR進行擴增； 5 擴增結果通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定或用標記地高辛的探針進行液相雜交，將雜交產物固定于包埋鏈酶親和素的微孔板中，經酶標抗地高辛抗體結合，底物顯色，對雜交結果進行鑒定。 結果： 1.實驗方法的建立1.1 最佳反應濃度的確定參照有關文獻，用方陣法來確定最佳反應條件。以病毒上清為標本，測定不同物質、不同濃度的OD值，計算出病毒上清OD值與空白對照

3、OD值平均值的比值，取比值最大值時的條件作為最佳反應條件。最終確定的最佳反應條件是：鏈霉親和素濃度為10mg/L，探針濃度為1.5μmol/L，抗地高辛堿性磷酸酶稀釋度為1:2500。 1.2 最佳反應時間的確定隨溫育時間不同，實驗最后目測顏色也不同，在一定時間內隨溫育時間延長，目測顏色加深(由無色變?yōu)辄S色)，OD值增大。實驗結果取值時，以陽性數值在0.8～2.0之間，空白對照OD值小于0.2，且陽性標本的OD值和空白對照的OD值的平均

4、值的差較大為標準來確定溫育時間的長短。此次實驗溫育時間是1小時。 1.3 酶聯免疫吸附試驗陰陽性界限的判定設置3孔空白對照作參照，計算空白對照OD值的平均值和標準差，截斷值(Cut-off)是空白孔的平均值加3倍的標準差。標本的OD值大于截斷值，則判為陽性；如標本的OD值小于截斷值，可判為陰性；如標本的OD值在截斷值附近，則重復做3孔，取3孔OD值的平均值最后確定結果。 2.方法學評價2.1 敏感性當擴增產物稀釋1000

5、倍時，微孔板雜交法仍能判為陽性；而用凝膠電泳法檢測，當擴增產物稀釋10倍時，目的條帶變得很弱，表明微孔板雜交法的敏感性為瓊脂糖凝膠電泳法的100倍。 2.2 特異性取健康人血清20份，非HFRS的發(fā)熱病人血清16份，乙肝病人血清2份進行同步擴增，凝膠電泳分析未見目的片斷，擴增產物繼續(xù)進行液相雜交，將雜交產物固定于包埋鏈酶親和素的微孔板中，經酶標抗地高辛抗體結合，底物顯色，對雜交結果進行鑒定，測定的OD值均小于Cut-off值，可

6、判為陰性。結果表明，微孔板雜交法具有較高的特異性。 2.3 重復性同一份病毒上清，在同一時間進行4管的微孔板雜交實驗，批內實驗均值為1.214，標準差為0.076，變異系數為0.063；同一份病毒上清，在不同時間1天，2天，7天，1個月，3個月，6個月分別進行微孔板雜交實驗，測定6次，批間實驗均值1.484，標準差0.311，變異系數為0.210。OD值均大于Cut-off值，結果均可判為陽性，表明該方法具有較好的重復性。 3.

7、檢測方法的應用3.1 血清標本IFA的檢測2007年共收集河北省各醫(yī)院臨床診斷HFRS病例血清標本89份，經IFA檢測血清中IgG抗體，其中陽性31份。 3.2 不同病程的HFRS患者血清標本瓊脂糖凝膠電泳法檢測取王IFRS陽性血清31份，進行RNA的提取，分別用Ⅰ型、Ⅱ型特異型引物進行套式PCR。擴增產物用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果有5份血清用Ⅱ型引物擴增出目的條帶，陽性率為16.13％，用Ⅰ型特異型引物均未出現目的條帶

8、。 3.3 不同病程的HFRS患者血清標本微孔板雜交法檢測對擴增產物用標記地高辛的探針進行液相雜交，然后將雜交產物固定于包埋鏈酶親和素的微孔板中，經酶標抗地高辛抗體結合，底物顯色，對雜交結果進行鑒定。共11份血清的OD值大于Cut-off值可判斷為陽性，陽性率為38.71％。 3.4 不同病程的HFRS患者血清標本瓊脂糖凝膠電泳法與微孔板雜交法檢測結果比較微孔板雜交法檢測陽性的11份血清均為用Ⅱ型引物擴增出的產物，其中電

9、泳出現目的條帶的5份血清均判為陽性，說明兩種方法具有很好的一致性。且微孔板雜交法的陽性檢出率高于瓊脂糖電泳法。 結論： 1.成功建立了用于HFRS患者早期診斷的敏感性的方法：微孔板雜交法。 2.微孔板雜交法檢測HFRS病毒上清的敏感性是瓊脂糖凝膠電泳法的100倍，該方法特異性高、重復性好。 3.應用微孔板雜交法檢測HFRS患者的陽性率高于瓊脂糖凝膠電泳法，特別是早期患者。 4 微孔板雜交法可用于H