微孔板雜交法對(duì)腎綜合征出血熱早期診斷的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：探索建立一種敏感特異的早期診斷腎綜合征出血熱的檢測(cè)方法。 方法： 1.從河北省各醫(yī)院采集臨床診斷為腎綜合征出血熱病人的急性期血清，用間接免疫熒光法(IFA)檢測(cè)血清中IgG抗體； 2.用間接免疫熒光法檢測(cè)到的陽性鼠肺標(biāo)本經(jīng)漂洗、研磨、過濾后制成病毒上清； 3.從病毒上清或IFA檢測(cè)王HFRS陽性的病人血清中提取漢坦病毒的總RNA，以RNA為模板，參考漢坦病毒的保守序列設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的c

2、DNA； 4 采用標(biāo)記有生物素的上游引物經(jīng)套式PCR進(jìn)行擴(kuò)增； 5 擴(kuò)增結(jié)果通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定或用標(biāo)記地高辛的探針進(jìn)行液相雜交，將雜交產(chǎn)物固定于包埋鏈酶親和素的微孔板中，經(jīng)酶標(biāo)抗地高辛抗體結(jié)合，底物顯色，對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行鑒定。 結(jié)果： 1.實(shí)驗(yàn)方法的建立1.1 最佳反應(yīng)濃度的確定參照有關(guān)文獻(xiàn)，用方陣法來確定最佳反應(yīng)條件。以病毒上清為標(biāo)本，測(cè)定不同物質(zhì)、不同濃度的OD值，計(jì)算出病毒上清OD值與空白對(duì)照

3、OD值平均值的比值，取比值最大值時(shí)的條件作為最佳反應(yīng)條件。最終確定的最佳反應(yīng)條件是：鏈霉親和素濃度為10mg/L，探針濃度為1.5μmol/L，抗地高辛堿性磷酸酶稀釋度為1:2500。 1.2 最佳反應(yīng)時(shí)間的確定隨溫育時(shí)間不同，實(shí)驗(yàn)最后目測(cè)顏色也不同，在一定時(shí)間內(nèi)隨溫育時(shí)間延長，目測(cè)顏色加深(由無色變?yōu)辄S色)，OD值增大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果取值時(shí)，以陽性數(shù)值在0.8～2.0之間，空白對(duì)照OD值小于0.2，且陽性標(biāo)本的OD值和空白對(duì)照的OD值的平均

4、值的差較大為標(biāo)準(zhǔn)來確定溫育時(shí)間的長短。此次實(shí)驗(yàn)溫育時(shí)間是1小時(shí)。 1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)陰陽性界限的判定設(shè)置3孔空白對(duì)照作參照，計(jì)算空白對(duì)照OD值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，截?cái)嘀?Cut-off)是空白孔的平均值加3倍的標(biāo)準(zhǔn)差。標(biāo)本的OD值大于截?cái)嘀?，則判為陽性；如標(biāo)本的OD值小于截?cái)嘀?，可判為陰性；如?biāo)本的OD值在截?cái)嘀蹈浇?，則重復(fù)做3孔，取3孔OD值的平均值最后確定結(jié)果。 2.方法學(xué)評(píng)價(jià)2.1 敏感性當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋1000

5、倍時(shí)，微孔板雜交法仍能判為陽性；而用凝膠電泳法檢測(cè)，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍時(shí)，目的條帶變得很弱，表明微孔板雜交法的敏感性為瓊脂糖凝膠電泳法的100倍。 2.2 特異性取健康人血清20份，非HFRS的發(fā)熱病人血清16份，乙肝病人血清2份進(jìn)行同步擴(kuò)增，凝膠電泳分析未見目的片斷，擴(kuò)增產(chǎn)物繼續(xù)進(jìn)行液相雜交，將雜交產(chǎn)物固定于包埋鏈酶親和素的微孔板中，經(jīng)酶標(biāo)抗地高辛抗體結(jié)合，底物顯色，對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行鑒定，測(cè)定的OD值均小于Cut-off值，可

6、判為陰性。結(jié)果表明，微孔板雜交法具有較高的特異性。 2.3 重復(fù)性同一份病毒上清，在同一時(shí)間進(jìn)行4管的微孔板雜交實(shí)驗(yàn)，批內(nèi)實(shí)驗(yàn)均值為1.214，標(biāo)準(zhǔn)差為0.076，變異系數(shù)為0.063；同一份病毒上清，在不同時(shí)間1天，2天，7天，1個(gè)月，3個(gè)月，6個(gè)月分別進(jìn)行微孔板雜交實(shí)驗(yàn)，測(cè)定6次，批間實(shí)驗(yàn)均值1.484，標(biāo)準(zhǔn)差0.311，變異系數(shù)為0.210。OD值均大于Cut-off值，結(jié)果均可判為陽性，表明該方法具有較好的重復(fù)性。 3.

7、檢測(cè)方法的應(yīng)用3.1 血清標(biāo)本IFA的檢測(cè)2007年共收集河北省各醫(yī)院臨床診斷HFRS病例血清標(biāo)本89份，經(jīng)IFA檢測(cè)血清中IgG抗體，其中陽性31份。 3.2 不同病程的HFRS患者血清標(biāo)本瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)取王IFRS陽性血清31份，進(jìn)行RNA的提取，分別用Ⅰ型、Ⅱ型特異型引物進(jìn)行套式PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果有5份血清用Ⅱ型引物擴(kuò)增出目的條帶，陽性率為16.13％，用Ⅰ型特異型引物均未出現(xiàn)目的條帶

8、。 3.3 不同病程的HFRS患者血清標(biāo)本微孔板雜交法檢測(cè)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用標(biāo)記地高辛的探針進(jìn)行液相雜交，然后將雜交產(chǎn)物固定于包埋鏈酶親和素的微孔板中，經(jīng)酶標(biāo)抗地高辛抗體結(jié)合，底物顯色，對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行鑒定。共11份血清的OD值大于Cut-off值可判斷為陽性，陽性率為38.71％。 3.4 不同病程的HFRS患者血清標(biāo)本瓊脂糖凝膠電泳法與微孔板雜交法檢測(cè)結(jié)果比較微孔板雜交法檢測(cè)陽性的11份血清均為用Ⅱ型引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物，其中電

9、泳出現(xiàn)目的條帶的5份血清均判為陽性，說明兩種方法具有很好的一致性。且微孔板雜交法的陽性檢出率高于瓊脂糖電泳法。 結(jié)論： 1.成功建立了用于HFRS患者早期診斷的敏感性的方法：微孔板雜交法。 2.微孔板雜交法檢測(cè)HFRS病毒上清的敏感性是瓊脂糖凝膠電泳法的100倍，該方法特異性高、重復(fù)性好。 3.應(yīng)用微孔板雜交法檢測(cè)HFRS患者的陽性率高于瓊脂糖凝膠電泳法，特別是早期患者。 4 微孔板雜交法可用于H