蘋(píng)果果生刺盤(pán)孢轉(zhuǎn)錄因子PacC對(duì)pH適應(yīng)性和致病過(guò)程中的功能.pdf

1、果生刺盤(pán)孢（Colletotrichum fructicola）是蘋(píng)果炭疽葉枯病(Glomerella leaf spot)的主要病原。蘋(píng)果炭疽葉枯病是近幾年我國(guó)蘋(píng)果生產(chǎn)中出現(xiàn)的流行性很強(qiáng)的病害，危害葉片和果實(shí)，引起葉斑、葉片干枯脫落、采前大量落果等癥狀，對(duì)蘋(píng)果產(chǎn)量和品質(zhì)威脅很大，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。
　　為了能在各種復(fù)雜的pH條件下生存，真菌形成適應(yīng)外部pH值的機(jī)制。轉(zhuǎn)錄因子PacC在真菌pH信號(hào)通路中處于核心位置，也是很多真菌的

2、毒力因子。該因子在不同pH下激活或者抑制一些基因的轉(zhuǎn)錄。由于在幼果期果實(shí)酸度較高，苦腐病侵染果實(shí)后處于潛伏侵染狀態(tài)，而果生刺盤(pán)孢在幼果期能夠引起典型斑點(diǎn)癥狀，這種特性是否與其對(duì)pH的適應(yīng)或調(diào)節(jié)能力有關(guān)，目前還不清楚。本研究針對(duì)果生刺盤(pán)孢利用基因敲除策略，開(kāi)展了PacC基因與生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、致病及pH適應(yīng)性關(guān)系研究，以期為該菌的致病機(jī)制及進(jìn)一步的防治提供理論依據(jù)，取得以下主要結(jié)果。
　　1)本研究采用split PCR技術(shù)構(gòu)建了含有潮霉

3、素（hph）的基因敲除盒，通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，獲得了抗潮霉素的轉(zhuǎn)化子，利用PCR檢測(cè)，鑒定出4個(gè)PacC的敲除突變體。
　　2)對(duì)突變體與野生型在生物學(xué)特性和致病力上差異進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在PDA上突變體生長(zhǎng)速率明顯下降，分生孢子萌發(fā)率和附著胞形成率明顯下降，說(shuō)明該基因?qū)ζ浞稚咦用劝l(fā)、附著胞形成和生長(zhǎng)速率具有較大影響。對(duì)嘎拉葉片進(jìn)行有傷和無(wú)傷接種，結(jié)果均顯示突變體病斑面積要顯著小于野生型，說(shuō)明PacC基因影響果生刺盤(pán)

4、孢侵入葉片和菌絲在葉片中的擴(kuò)展。對(duì)嘎拉果實(shí)進(jìn)行無(wú)傷接種，結(jié)果顯示突變體不發(fā)病野生型發(fā)病，說(shuō)明PacC基因影響果生刺盤(pán)孢侵入果實(shí)。有傷接種結(jié)果顯示突變體和野生型差異不顯著，有待進(jìn)一步研究菌絲在蘋(píng)果組織中的擴(kuò)展。接種結(jié)果表明PacC基因影響果生刺盤(pán)孢致病力。通過(guò)構(gòu)建互補(bǔ)載體，獲得PacC的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子，G418和PCR檢測(cè)出陽(yáng)性互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子，對(duì)其進(jìn)行上述表型觀察和致病力檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子在菌落形態(tài)和生長(zhǎng)速率、孢子萌發(fā)率、附著胞形成率和對(duì)嘎拉葉

5、片的致病力均能恢復(fù)到野生型狀態(tài)，表明敲除突變體的生物學(xué)變化和致病力變化確實(shí)是由于PacC基因的缺失引起。
　　3)在不同pH的培養(yǎng)基培養(yǎng)，結(jié)果顯示在pH3時(shí)，突變體和野生型生長(zhǎng)差異不顯著，在pH4至pH6，突變體比野生型生長(zhǎng)速率顯著變慢，且隨著pH增加，突變體與野生型生長(zhǎng)速率差值越來(lái)越大，表明PacC在酸性條件下可以促進(jìn)果生刺盤(pán)孢的生長(zhǎng);在pH8培養(yǎng)基上，突變體菌落生長(zhǎng)明顯變慢;在pH9時(shí)，突變體不能生長(zhǎng)，而野生型雖受到抑制，仍能