2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、茶氨酸(Theanine)是1950年首次從綠茶中分離得到的,是茶葉中的特征氨基酸,也是茶葉的呈味物質(zhì)之一,具有很好的生理功能和商業(yè)價值。其制備研究是目前茶學(xué)研究中的一個熱點。由于從茶葉中提取高純度的茶氨酸,成本高昂;化學(xué)合成茶氨酸工藝較復(fù)雜;組織培養(yǎng)合成茶氨酸產(chǎn)量低。開展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理論意義和實踐價值。本論文針對茶氨酸的微生物發(fā)酵法制備技術(shù),開展了菌株篩選和工程菌構(gòu)建兩方面工作,將生物技術(shù)運用到天然產(chǎn)物制備技術(shù)中。本

2、論文通過比較不同微生物催化L-谷氨酰胺(L-Gln)和鹽酸乙胺合成茶氨酸的能力大小,對微生物進行了篩選,明確了9種微生物催化合成茶氨酸的能力;通過基因克隆技術(shù)構(gòu)建了重組菌,優(yōu)化了重組菌催化合成茶氨酸的條件,重組菌株酶活達到出發(fā)菌株的15倍,茶氨酸產(chǎn)量達到29.40g/L。主要研究結(jié)果如下: 1、對9種微生物催化L-谷氨酰胺和鹽酸乙胺合成茶氨酸的能力進行了測試,發(fā)現(xiàn)它們催化合成茶氨酸的能力都很低。茶氨酸的最大生成量僅為7.9mg/

3、L。 2、以培養(yǎng)好的EscherichiacoliDH5α(E.coliDH5α)菌液為模板進行PCR反應(yīng),將擴增出的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因片斷和載體pET-32a相連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-GGT,將重組質(zhì)粒pET-GGT轉(zhuǎn)化至E.coliBL21中,構(gòu)建重組菌。重組菌株經(jīng)0.05mMIPTG在32℃誘導(dǎo)后,SDS-PAGE結(jié)果顯示出明顯的特征蛋白質(zhì)條帶。經(jīng)酶活性檢測,重組菌株每克濕菌體的酶活達到2.0U/ml左右,約是出發(fā)菌株E

4、.coliDH5α的15倍。 3、本實驗優(yōu)化了重組菌催化L-谷氨酰胺和鹽酸乙胺合成茶氨酸的反應(yīng)條件,重組菌經(jīng)37℃培養(yǎng)2h左右,然后再加IPTG至0.05mM于32℃誘導(dǎo)表達4h收集菌體。1ml反應(yīng)體系(含0.35ML—谷氨酰胺、2.0M鹽酸乙胺、70mg/ml菌體、pH9.5)于30℃培養(yǎng)4小時,茶氨酸的最大生成量為29.40g/L,即每克濕菌體可催化合成茶氨酸的量為420g/L。L-Gln轉(zhuǎn)化率為48.22%。Suzuki等

5、報道的用構(gòu)建的重組菌催化谷氨酰胺(Gln)和乙胺合成茶氨酸的量為20.90g/L,Gln轉(zhuǎn)化率為60%。本實驗中的L-Gln轉(zhuǎn)化率稍低,但是茶氨酸產(chǎn)量有所提高。 本實驗構(gòu)建的重組菌具有較好的催化L—谷氨酰胺和鹽酸乙胺合成茶氨酸的能力,可以嘗試用其進行發(fā)酵生產(chǎn)茶氨酸小試實驗,可以嘗試將本實驗構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到不同表達載體系統(tǒng)中,以尋找更適合γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶大量表達的載體系統(tǒng)。本實驗對于微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)茶氨酸等方面的工作具有

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