痰瘀互結(jié)證冠心病模型的病理機制及方證相應基礎研究.pdf

1、本文在前期疾病模型研究和臨床研究的基礎上,首次利用復合方法在小型豬體內(nèi)建立病證結(jié)合的痰瘀互結(jié)證冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病,下同)模型；運用冠狀動脈造影結(jié)合血管內(nèi)超聲以及虛擬組織成像等技術(shù),觀察冠狀動脈粥樣硬化的演變過程；從內(nèi)皮組織損傷、冠脈血管斑塊穩(wěn)定性到差異蛋白質(zhì)表達、細胞死亡模式等多層面、多指標研究冠心病疾病模型的病理機制,揭示痰瘀互結(jié)證候的演化過程。同時選用經(jīng)典方藥對病證結(jié)合模型進行治療,初步探討方證相應理論的規(guī)律與本質(zhì)

2、,并對模型的可靠性及病理演化過程進行反證。
　　 1.痰瘀互結(jié)證冠心病小型豬模型的建立
　　 材料與方法
　　 選用中國實驗小型豬(Chinese experimental miniature swine,CEMS)隨機分為4組:(1)正常對照組(Con):普通飼料,不拉傷冠脈血管,n=8；(2)血瘀阻脈證候模型組(YY):單純冠脈拉傷,n=6；(3)痰濁壅盛證候模型組(TT):單純高脂飼料,n=6；(4)痰瘀互

3、結(jié)證候模型組(TY):冠脈拉傷+高脂飼料,n=6。對于TY模型而言,高脂飼料喂養(yǎng)2周后,小型豬冠脈行球囊過擴張3次,每次30s,并輕微拉動球囊2次。手術(shù)結(jié)束后,連續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)8周(week,w)。其他實驗方法見附表(第14頁,supplementary table)。
　　 結(jié)論
　　 三種不同的造模方法(YY,TT,TY)對小型豬心肌缺血過程中一般情況、血管活性物質(zhì)釋放、缺血反應以及冠脈的改變均有不同程度的影響,但僅

4、復合方法(TY)對上述主要指標均有明顯的作用,說明復合因素模型綜合單純冠脈損傷(YY)和單純高脂飼料喂養(yǎng)(TT)兩種技術(shù)優(yōu)勢,符合痰瘀互結(jié)的病證結(jié)合理論,也有助于解釋中醫(yī)證候?qū)W說的科學內(nèi)涵。本研究分別對胸痹心痛的主癥、兼癥、舌象及舌下脈絡和脈象進行標準化評分和統(tǒng)計學處理。這種在動物體內(nèi)模擬中醫(yī)臨床過程的研究方法,通過對動物自身信息特征的挖掘,將有利于推動病證結(jié)合模型研究的發(fā)展。
　　 2痰瘀互結(jié)證冠心病病理演化過程研究
　

5、　 材料與方法
　　 36只中國實驗小型豬,隨機分為6組,每組6只:(1)正常對照組(Con):普通飼料,不拉傷冠脈血管；(2)2w+6h模型組(Model-2w+6h):高脂飼料喂養(yǎng)2w+冠脈拉傷后6h；(3)3w模型組(Model-3w):高脂飼料喂養(yǎng)2w+冠脈拉傷后1w；(4)4w模型組(Model-4w):高脂飼料喂養(yǎng)2w+冠脈拉傷后2w；(5)6w模型組(Model-6w):高脂飼料喂養(yǎng)2w+冠脈拉傷后4w；(6)1

6、0w模型組(Model-10w):高脂飼料喂養(yǎng)2w+冠脈拉傷后8w。其余實驗方法同前。
　　 結(jié)論
　　 本文從血液流變學、內(nèi)皮組織損傷和冠脈血管病理生理指標入手,結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)證候研究方法,通過連續(xù)、綜合因素、多指標觀察證候模型的研究,揭示痰瘀互結(jié)證候的演化過程。在此過程中,血脂異常為始動因素,進而導致血液流變學異常；內(nèi)皮細胞破壞,導致血管舒縮功能下降,在炎性介質(zhì)的參與下血管受損處逐漸出現(xiàn)脂質(zhì)沉積,引發(fā)心肌缺血表現(xiàn),最終

7、可影響心臟的收縮功能。
　　 3小型豬冠狀動脈粥樣硬化的IVUS-VH研究
　　 方法
　　 行冠脈造影后,將超聲導絲置入冠狀動脈LAD中下部,手動回撤IVUS導管,觀察受損血管的程度和受累血管的長度。再次進入IVUs導管,進行圖像采集和記錄。IVUS-VH數(shù)據(jù)存儲于硬盤,實驗完成后進行分析。斑塊的邊界利用灰階(Grey scale)圖像獲得。VH軟件自動分析斑塊的構(gòu)成和對應的比例。
　　 結(jié)論
　

8、　 冠脈損傷后隨著高脂飲食時間的延長,動脈粥樣硬化斑塊逐漸發(fā)展,壞死和鈣化斑塊的比例升高提示斑塊的穩(wěn)定性降低；IVUS-VH對于小型豬冠脈特點的分析與血管組織學的吻合度較好。
　　 4痰瘀互結(jié)證冠心病模型小型豬血清蛋白組學研究
　　 方法
　　 應用雙向凝膠電泳(2-DE)、基質(zhì)輔助激光解析-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)等先進的蛋白質(zhì)組學技術(shù)方法,對正常和痰瘀互結(jié)證冠心病模型動物的血清進行蛋白提取、

9、分離及鑒定。
　　 正常對照組(Con,n=30)和模型組(Model,n=30)血清樣品經(jīng)處理備用,WCX磁珠經(jīng)預處理,制備蛋白芯片,用SELDI-TOF-MS進行檢測芯片,BiomarkerWizard version3.1軟件處理蛋白峰并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。
　　 結(jié)論
　　 小型豬動脈粥樣硬化模型與正常動物的血清蛋白質(zhì)組差異明顯；鑒定出的C4BP、apoE等差異蛋白功能特性與痰瘀互結(jié)證冠心病免疫調(diào)控、脂質(zhì)代謝、

10、急慢性炎癥反應等過程密切相關(guān)；篩選到的M/Z8634可以作為血清生物學標志物,用以區(qū)分模型組和正常對照組動物血清。
　　 5小型豬心肌缺血后細胞死亡模式研究
　　 方法
　　 心肌病理組織學觀察細胞壞死,纖維增生；利用電鏡技術(shù)觀察心肌細胞、毛細血管形態(tài)及雙層膜包繞的自噬小體的形成；Western Blotting檢測Beclin1(哺乳動物自噬的標記蛋白,參與自噬體膜的形成)、LC3(微管相關(guān)蛋白1輕鏈3,MAP

11、1LC3)蛋白表達:免疫組化法檢測Cathepsin B、D和Caspase-3、9的表達；通過Caspase-3活力檢測及Tunel染色(FITC)觀察細胞凋亡的情況。
　　 結(jié)論
　　 冠脈損傷最終可導致心肌血流供應障礙,壞死、凋亡及自噬均可發(fā)生,而且共同作用引起心肌細胞的缺失。掌握自噬作用與細胞凋亡、壞死的相互關(guān)系,有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和策略。
　　 6痰瘀互結(jié)證冠心病方證相應的探索性研究
　　

12、材料與方法
　　 36只中國實驗小型豬,隨機分為6組,每組6只:(1)正常對照組(Con):普通飼料,不拉傷冠脈血管；(2)模型組(Model):冠脈拉傷+高脂飼料；(3)西藥對照組(XY):辛伐他汀0.5mg/kg；(4)化痰組(HT):瓜蔞薤白半夏湯6g生藥/kg；(5)祛瘀組(QY):血府逐瘀湯8g生藥/kg:(6)痰瘀同治組(TY):瓜蔞薤白半夏湯3g生藥/kg合血府逐瘀湯4g生藥/kg。冠脈拉傷后第2天開始給藥,同時繼

13、續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料,持續(xù)8周。
　　 結(jié)論
　　 在改善BMI和血脂增加方面,化痰法具有較好的治療作用,而單獨祛瘀法和痰瘀同治法作用較差；痰瘀互結(jié)證病理過程中的血管活性因子和炎性因子釋放、血流動力學改變和冠脈狹窄等是痰瘀同治方的作用靶點,因此痰瘀同治可以更好地體現(xiàn)方證相應的治療原則,取得最佳療效。
　　 綜上所述,本文在建立痰瘀互結(jié)冠心病病證結(jié)合的小型豬動物模型基礎上,探索其病理機制。利用傳統(tǒng)方藥進行干預,探討方證相

14、應理論的規(guī)律與本質(zhì),并對模型建立的可靠性及病理演化過程進行驗證。特異的蛋白質(zhì)表達模式和心肌細胞死亡模式的研究則有助于尋找基本的生物學標志物及藥物干預的新靶點。本文的創(chuàng)新性主要有如下幾點:
　　 1.采用高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合冠脈內(nèi)皮損傷復合方式,在實驗小型豬體內(nèi)建立了新的痰瘀互結(jié)證冠心病病證結(jié)合的動物模型；
　　 2.引入并初步建立病證結(jié)合動物模型的擬臨床評價方法,從血液流變學、血管活性物質(zhì)釋放、炎性因子激活、冠脈內(nèi)皮異常等方