淀粉樣β-蛋白神經(jīng)毒作用的煙堿受體機制：電生理和細胞內(nèi)鈣成像研究.pdf

1、阿爾茨海默病(AD的典型病理特征之一是腦內(nèi)出現(xiàn)高密度的老年斑，老年斑的主要成份是由39～43個氨基酸組成的淀粉樣β-蛋白(Amyloid β-protein，Aβ)。AD的另一個典型的病理特征是，基底前腦膽堿能神經(jīng)元發(fā)生退行性變和繼發(fā)的大腦皮層及海馬膽堿能系統(tǒng)功能障礙。膽堿能受體包括毒蕈堿型和煙堿型兩大類。有報道表明，相對于毒蕈堿型受體或其它受體而言，AD病人腦內(nèi)更多的是煙堿受體水平的明顯下降。本研究進行了如下工作： (1)利用

2、場電位記錄手段，研究了三種不同的Aβ片段(Aβ<,25-35>、Aβ<,31-35>和Aβ<,35-31>)對在體海馬LTP誘導(dǎo)的作用以及可能的nAChRs機制； (2)采用全細胞膜片鉗技術(shù)觀察了nAChRs是否在急性分離的海馬CA1神經(jīng)元上有功能性的表達，以及Aβ對nAChRs電流的調(diào)制作用； (3)使用熒光Ca<'2+>成像技術(shù)研究了Aβ引起[ca<'2+>]<,i>增加的nAChRs機制。除此之外，本研究在所有實驗

3、中，都觀察了三種不同的Aβ片段的作用，通過對三者作用的比較，試圖證實先前提出的假說，即Aβ<,31-35>可能是全長Aβ分子發(fā)揮神經(jīng)毒性作用的更短的活性中心。 第一部分：淀粉樣β-蛋白對大鼠在體海馬CA1區(qū)LTP的壓抑作用及其nAChRs機制研究 為研究不同的Aβ片段對大鼠在體海馬CA1區(qū)LTP的作用及Aβ?lián)p傷LTP可能的nAChRs機制，本實驗將麻醉大鼠固定在腦立體定位儀上，通過給予海馬Schaffer側(cè)枝單個電刺激、

4、強直電刺激或雙脈沖刺激，在海馬CA1區(qū)誘發(fā)和記錄基礎(chǔ)的場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potentials，fEPSPs)、強直刺激引起的fEPSPs的長時程增強即LTP以及配對脈沖引起的雙脈沖易化(paired pulse facilitation，PPF)。經(jīng)腦室套管向側(cè)腦室內(nèi)注射各種Aβ片段及nAChRs特異性激動劑或拮抗劑后，觀察了各種藥物對基礎(chǔ)fEPSPs、LTP以及PPF的影響

5、。 結(jié)果表明：(1)Aβ<,31-35>和Aβ<,25-35>對在體海馬LTP誘導(dǎo)具有同等程度的傷害作用，支持我們先前提出的假設(shè)，即Aβ<,31-35>可能是全長Aβ分子中一個更短的具有類似神經(jīng)毒性作用的活性片段；(2)α4β2亞型nAChR介導(dǎo)了Aβ對在體海馬CA1區(qū)LTP的壓抑作用，提示α4β2亞型nAChR可能是AD時Aα的攻擊靶標(biāo)之一；(3)Aα或epibatidine對大鼠在體海馬CA1區(qū)LTP的壓抑作用以及D-bet

6、a-E的反轉(zhuǎn)效應(yīng)與突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放無關(guān)。 第二部分：淀粉樣β-蛋白對大鼠急性分離的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元nAChRs全細胞膜電流的影響 本實驗利用全細胞膜片鉗技術(shù)，在鉗制電位為-70 mV時，通過重力灌流系統(tǒng)急性給予各種nAChRs激動劑及不同的Aβ片段，記錄了急性分離的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元nAChRs介導(dǎo)的全細胞電流，觀察了不同的Aβ片段對非選擇性nAChRs激動劑nicotine、特異性α7nAChRs激動劑cho

7、line和特異性α4β2 nAChRs激動劑epibatidine誘發(fā)電流的影響。 結(jié)果顯示：(1)在急性分離的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元，nicotine、choline和epibatidine都可以有效的誘發(fā)內(nèi)向電流，表明在海馬神經(jīng)元上同時有α7和α4β2亞型的nAChRs存在，并且，它們介導(dǎo)的電流有不同的脫敏特征；(2)各種Aβ片段預(yù)處理對nicotine、choline和epibatidine誘發(fā)的電流有可逆性壓抑作用，表明

8、α7和α4β2亞型的nAChRs在AD病理過程中可能是Aβ分子發(fā)揮神經(jīng)毒性作用的生物靶；(3)Aβ<,25-35>和Aβ<,31-35>在壓抑nicotine電流中表現(xiàn)出的相似作用，提示Aβ<,31-35>可能是全長Aβ發(fā)揮壓抑nicotine電流效應(yīng)時更短的活性片段。 第三部分：淀粉樣β-蛋白對細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響及其可能的nAChRs機制 本實驗使用激光掃描共聚焦顯微鏡成像系統(tǒng)進行細胞內(nèi)熒光Ca<'2+>成像實驗，

9、觀察了各種Aβ片段對原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元細胞內(nèi)Ca<'2+>濃度(intracellular calciumconcentration，[Ca<'2+>]<,i>)的影響，并通過使用nAChRs的非特異性拮抗劑mecamylamine(MCA)以及α4β2亞型nAChRs特異性拮抗劑dihydro-beta-erythroidine(D-beta-E)初步探討了Aβ引起[Ca<'2+>]<,i>升高過程中可能的nAChRs機制。

10、 鈣成像實驗結(jié)果表明：(1)Aβ<,25-35>和Aβ<,31-35>均可使原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元[Ca<'2+>]<,i>升高，提示Aβ的神經(jīng)毒性與Aβ引起的細胞內(nèi)鈣超載有關(guān)；同時，兩個Ap片段發(fā)揮效應(yīng)的一致性說明Aβ<,31-35>可能是全長Aβ分子中具有同樣生物活性的更短片段。(2)nAChRs，包括α4β2亞型，至少部分地參與了Aβ<,25-35>和Aβ<,31-35>誘導(dǎo)的[Ca<'2+>]<,i>升高；中樞nAChRs的功

11、能障礙可能是Aβ引起神經(jīng)元Ca<'2+>超載和導(dǎo)致認知功能損害的原因之一。 總之，本研究利用電生理的細胞外場電位記錄和全細胞膜片鉗手段，結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡Ca<'2+>熒光成像技術(shù)，通過記錄大鼠在體海馬LTP、引導(dǎo)急性分離海馬CA1神經(jīng)元nAChRs電流以及測定神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子水平的變化，探討了與AD發(fā)病密切相關(guān)的Aβ的神經(jīng)毒性作用以及可能的nAChRs機制。研究結(jié)果不僅表明，Aβ<,31-35>和Aβ<,25-35>均