抵抗素對原代培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO、ET-1、TGF-β-,1-的影響.pdf

1、目的：通過臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的原代培養(yǎng)，建立血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外模型，研究抵抗素(Resistin)對原代培養(yǎng)的HUVECs分泌一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1)和轉(zhuǎn)化生長因子-β<,1>(TGF-β<,1>)及TGF-β<,1>基因表達(dá)的影響，并觀察脂聯(lián)素(Adiponectin)對HUVECs的保護(hù)作用。 方法：采用膠原酶消化法分離

2、培養(yǎng)HUVECs，建立血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型，取4～6代細(xì)胞用于實驗。培養(yǎng)的HUVECs接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，生長至70％融合狀態(tài)，同步化處理細(xì)胞，記為0時。將細(xì)胞分為四組：Ⅰ組為對照組，培養(yǎng)液為無血清RPMI1640液。Ⅱ組為抵抗素刺激組，培養(yǎng)液為含有l(wèi)Ong/ml、50ng/ml、100ng/ml抵抗素的RPMI1640液。Ⅲ組為抵抗素+抗抵抗素抗體組，每孔抗抵抗素抗體終濃度為2μg/ml，抵抗素終濃度為100ng/ml。Ⅳ組

3、為脂聯(lián)素組，每孔脂聯(lián)素終濃度為10μg/ml，抵抗素終濃度為100ng/ml。分別于24h、48h時收集細(xì)胞上清液，離心去除細(xì)胞碎片，應(yīng)用硝酸酶還原法測定NO的水平，應(yīng)用放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)測定ET-1的水平，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)測定TGF-β<,1>的水平。 培養(yǎng)的HUVECs接種子6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，當(dāng)HUVEC

4、s生長至95％融合狀態(tài)，同步化處理細(xì)胞，記為0時。將細(xì)胞分為四組：A組為對照組，培養(yǎng)液為無血清RPMI 1640液。B組為抵抗素刺激組，培養(yǎng)液為含有100ng/ml抵抗素的RPMI 1640液。C組為抵抗素+抗抵抗素抗體組，每孔抗抵抗素抗體終濃度為2μg/ml，抵抗素終濃度為100ng/ml。D組為脂聯(lián)素組，每孔脂聯(lián)素終濃度為lOμg/ml，抵抗素終濃度為100ng/ml。消化收集0、12h、24h的各組細(xì)胞，用異硫氰酸胍一步法抽提總R

5、NA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，以肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參照，觀察細(xì)胞內(nèi)TGF-β<,1>mRNA的變化。 結(jié)果1.在倒置相差顯微鏡下HUVEC呈多角形，胞核清晰，呈橢圓形。細(xì)胞單層貼壁生長呈“鋪路石”樣排列。經(jīng)Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可被染上黃綠色熒光。2．與對照組相比，抵抗素對HUVEC分泌NO無明顯影響，生理劑量的脂聯(lián)素能夠促進(jìn)HUVEC分泌

6、NO(P<0.05)。與對照組比較，在超過生理劑量抵抗素刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞分泌ET-I、TGF-β<,1>較對照組明顯增高(P<0.01，P<0.05)，呈劑量依賴性，尤以100ng/ml濃度作用最強(qiáng)。預(yù)先加入抗抵抗素IgG后，抵抗素的作用被完全抑制，而生理劑量的脂聯(lián)素對高濃度抵抗素引起的ET-1分泌無明顯影響但能夠部分抑制高濃度抵抗素引起的TGF-β<,1>分泌。3．經(jīng)RT-PCR半定量分析，高濃度抵抗素能夠上調(diào)TGF-β<,l>mRN