足底電擊誘導(dǎo)樹鼩條件恐懼記憶模型的建立及抹除.pdf

1、目的:
　　痛覺和恐懼被認為是有機體對外來傷害的一種有利的保護性行為，它的產(chǎn)生和建立對行為和健康有著強烈的影響。然而，如果痛覺和恐懼在不適當?shù)臅r候被激活或者持續(xù)時間過長則會對機體產(chǎn)生傷害。樹鼩作為類靈長類哺乳動物，在解剖、生理、免疫及進化等各方面與人類高度相似，因此，建立樹鼩恐懼記憶動物模型可為研究人類相關(guān)疾病提供更好的動物模型。
　　材料與方法:
　　1.實驗Ⅰ：探索樹鼩在明暗箱中的活動規(guī)律該實驗包含三個階段：訓(xùn)練階

2、段、適應(yīng)階段和實驗階段。在訓(xùn)練階段，所有的動物在無電刺激的情況下每天允許在明暗箱中自由活動30min；在適應(yīng)階段，動物被允許進行環(huán)境及實驗節(jié)奏的適應(yīng)，共持續(xù)3d；在實驗階段，每只動物進行10min的測試（每次測試記錄前有3min的適應(yīng)時間以消除應(yīng)激反應(yīng)帶來的誤差）。實驗階段對動物的處理與適應(yīng)階段一致，同時進行動物行為的記錄、處理與分析。分析記錄的行為指標包括移動距離、平均移動速率、停留時間以及在兩箱之間的穿梭次數(shù)。本次實驗獨立重復(fù)三次。

3、
　　2.實驗Ⅱ：尋找電擊樹鼩足底合適的電壓該實驗兩個隔室皆為明室（即都用LED提供照明）。這個實驗由兩個階段組成：適應(yīng)階段和測試階段。適應(yīng)階段與實驗Ⅰ相應(yīng)階段一致。3d適應(yīng)性訓(xùn)練之后進行測試階段的實驗。在測試階段，動物有10min的測試時間，在這10min內(nèi)，隨機選擇一個隔室給予電刺激。電刺激的程序為：每隔30s時間給10s的電刺激，電壓從0V遞增至20V，增幅為4V。本實驗中在一個電壓下將所有動物測試完后調(diào)至下一電壓進行下一輪

4、測試，尋找合適的電擊電壓。
　　3.實驗Ⅲ：樹鼩條件恐懼記憶的建立該實驗由4個階段組成：適應(yīng)階段、刺激前階段、恐懼記憶形成階段、恐懼記憶維持階段。適應(yīng)階段的處理和實驗Ⅰ中相應(yīng)階段一致。在恐懼記憶形成階段，動物在明箱中不給予電擊，動物一進入暗箱中就給予合適足底脈沖電刺激，以建立恐懼記憶，并形成對黑暗的條件刺激。刺激電壓由穩(wěn)壓電源提供，電脈沖由時間繼電器控制。電脈沖刺激程序與實驗Ⅱ中的電脈沖程序一致。所有動物進入實驗裝置時兩箱均為明箱

5、，在動物適應(yīng)環(huán)境之后隨機選擇一個隔室關(guān)LED燈，隨后進行記錄。對照組不給電刺激，其他處理完全一致。所有動物每天只進行1次實驗。
　　4.實驗Ⅳ：樹鼩條件恐懼記憶的抹除在實驗組動物形成條件恐懼7周后，啟動記憶抹除實驗。該實驗包括3個階段即原恐懼記憶維持階段、新恐懼記憶建立階段和原恐懼記憶抹除階段。在新恐懼記憶建立階段，動物一到明箱就受到足底電擊刺激，刺激電壓由穩(wěn)壓電源提供，電脈沖由時間繼電器控制。電脈沖程序與實驗Ⅲ中的電脈沖程序一致

6、，連續(xù)刺激4d。隨后的觀察階段撤去電刺激。所有動物進入實驗裝置時兩箱均為暗箱，在動物適應(yīng)環(huán)境之后隨機選擇一個隔室開LED燈，隨后進行記錄。每只動物每天只進行1次實驗。
　　5.數(shù)據(jù)收集所有的實驗均在14∶00～18∶00之間進行的。在測試階段的10 min內(nèi)，動物在每個隔間內(nèi)的活動情況由攝像機記錄，通過行為學(xué)分析軟件EthoVision XT9（Noldus，Wageningen,the Netherlands）進行分析，統(tǒng)計出動

7、物在每個隔間內(nèi)的停留時間（Duration）、移動速率(Velocity)、移動距離(Distance)、在兩隔室間的穿梭次數(shù)(Frequency)等數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。在處理視頻過程中，如果動物處于兩個隔室的之間，我們規(guī)定以動物的中心為參考點進行處理。
　　6.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析所有的數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)表示形式為均數(shù)±標準誤（x±s）表示，數(shù)據(jù)的計算及統(tǒng)計圖表的生成由軟件Graph Pad Prism5.0

8、完成。實驗Ⅰ和實驗Ⅱ中的數(shù)據(jù)采用配對t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗Ⅲ和Ⅳ中的數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析統(tǒng)計學(xué)分析。P<0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1．實驗Ⅰ：探索樹鼩在明暗箱中的活動規(guī)律在沒有任何刺激情況下，讓樹鼩在明暗箱中自由活動。結(jié)果顯示，樹鼩在暗箱中停留時間為（476.773±26.965） s,而明箱中只有（117.075±31.176）s。兩者相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。樹鼩在明暗兩箱中的移動距離

9、無統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），在兩箱中的移動速率有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。其在兩箱間的穿梭次數(shù)為（21.42±4.245）次。以上結(jié)果表明樹鼩雖然是一種晝行性動物，但更喜歡停留在暗箱之中；明箱中停留時間少、移動距離大、平均速率高等特點與樹鼩白天外出覓食習性相符，表明樹鼩的活動規(guī)律并沒有因為明暗箱而改變。
　　2．實驗Ⅱ：尋找電擊樹鼩足底合適的電壓在兩相同的明室中，僅在一室中給予不同電壓足底電擊，樹鼩（n=6）表現(xiàn)出不同的活動特

10、征。0、4、8V電壓下，樹鼩在兩個隔室中的停留時間、移動速率、移動距離、穿梭次數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。當電壓在12V以上，樹鼩在有電刺激的隔間停留時間開始有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。移動速率和移動距離在16V前均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），20V時移動速率有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。穿梭次數(shù)在16V以上時有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。由于20 V電壓下樹鼩的傷害較大，考慮到動物的福利保護和更強的刺激效果遂選用16V電壓作

11、為合適電壓進行電擊，并用于接下來的實驗中。
　　3．實驗Ⅲ：樹鼩條件恐懼記憶的形成動物隨機分為實驗組（n=4，暗箱中給予足底電刺激）和對照組（n=4，無電刺激）。結(jié)果顯示，兩組樹鼩在電刺激前均喜歡在暗箱中活動，符合樹鼩的喜暗習性。在電刺激后實驗組樹鼩在明箱中的停留時間、移動距離均增大（P<0.001），平均移動速率減少（P<0.001）。而暗箱中則相反，其在暗箱中的停留時間、移動距離均減少（P<0.001），平均移動速率增大（P<

12、0.001）。樹鼩在兩箱間的穿梭次數(shù)減少（P<0.001）。以上結(jié)果表明樹鼩對暗箱的恐懼記憶已經(jīng)形成。
　　4．實驗Ⅳ：樹鼩條件恐懼記憶的抹除在結(jié)束恐懼記憶維持階段后，啟動記憶抹除實驗。結(jié)果顯示，在明箱中給予電刺激之前，實驗組樹鼩對暗箱的恐懼并未消退。在電刺激之后實驗組樹鼩在明箱中的停留時間、移動距離均減少（P>0.05），平均移動速率增大（P>0.05）。而暗箱中則相反，其在暗箱中的停留時間、移動距離均增大（P>0.05），平均