腎虛血瘀證老年癡呆樹鼩復合模型的初步建立與田七益智顆粒方藥效評價.pdf

1、目的:以樹鼩為研究對象，初步探討研究腎虛血瘀證老年性癡呆樹鼩動物模型建立的最佳方法并以田七益智顆粒方進行藥效評價。從而為中醫(yī)以樹鼩為對象、民族醫(yī)藥防治老年性癡呆及相關藥物的研發(fā)提供穩(wěn)定、可重復的中醫(yī)病證結合動物模型。
　　方法:老年癡呆病模型的建立:以正常飼養(yǎng)的樹鼩為對象，隨機分為5組:空白組，0.96％D-半乳糖組，1.92％D-半乳糖組，Aβ23-35+IBO(5μg+5μg)組，Aβ23-35+IBO(10μg+5μg)組。

2、將不同濃度的D-半乳糖分別按0.5ml/100g的體重劑量腹腔注射，每天一次，連續(xù)6周;第7周開始樹鼩腦室雙側大腦Meynert基底核注射鵝膏蕈氨酸(IBO)。Aβ23-35+IBO兩組分別直接在樹鼩腦室雙側大腦Meynert基底核注射Aβ23-35+IBO混合液，空白組注射等劑量的生理鹽水，制備老年癡呆動物模型。以Morris水迷宮實驗為基礎探索測定樹鼩的行為學;高壓液相色譜法測定腦組織去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺

3、(5-HT)的含量;westernblot檢測腦組織Aβ、APP和磷酸化tau蛋白的表達;HE染色法檢測樹鼩海馬區(qū)腦組織病理形態(tài)變化以及免疫組化法檢測腦內(nèi)突觸素(SYP)、乙酰膽堿轉移酶(Chat)的活性。
　　腎虛血瘀證模型的建立:以正常飼養(yǎng)的樹鼩為對象，隨機分為3組:空白組，腎虛血瘀證模型1組，腎虛血瘀證模型2組:模型1、2組在第1-3天腹腔注射1mg/100g的氫化可的松，第4、5天繼續(xù)腹腔注射1.5mg/100g的氫化可的

4、松;在第6-8天，模型1組腹腔注射腎上腺素1mg/100g;模型2組腹腔注射角叉菜膠7.5mg/100g。通過觀察記錄樹鼩一般體質(zhì)形態(tài)特征變化以及比較臟器指數(shù)體現(xiàn)動物模型的表證情況;采用化學發(fā)光法測定血漿FT3、FT4、E2、T的含量變化;血液流變儀分別測定全血高切、全血中切Ⅰ、全血低切Ⅰ、全血低切Ⅱ的粘度、血漿粘度、紅細胞壓積高切還原粘度、中切還原粘度、低切還原粘度、卡松粘度、卡松屈服應力、以及纖維蛋白原。
　　腎虛血瘀證老年癡

5、呆樹鼩動物模型的初步建立與藥效評價:將正常飼養(yǎng)的雄性樹鼩隨機分為4組，每組15只:空白組、老年性癡呆病組（以下簡稱AD組）、腎虛血瘀證老年癡呆病組（以下簡稱病證結合組）、田七益智顆粒方藥效評價組（以下簡稱給藥組）。AD病組、病證結合組、給藥組分別腦室雙側注射Aβ23-35和IBO的混合液，制備老年癡呆樹鼩模型。腦部注射傷口愈合后，病證結合組、給藥組在第1-3天腹腔注射氫化可的松1mg/100g，第4-6天皮下注射腎上腺素0.1mg/10

6、0g;第7天開始對給藥組灌胃給予田七益智方藥液1ml/100g.d，連續(xù)10天;空白組注射等量的生理鹽水。通過觀察記錄樹鼩體質(zhì)質(zhì)量及一般狀態(tài);高壓液相色譜法測定腦組織去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)的含量;western blot檢測腦組織Aβ、APP和磷酸化tau蛋白的表達;HE染色法檢測樹鼩海馬區(qū)腦組織病理形態(tài)變化以及乙酰膽堿轉移酶(Chat)、免疫組化法檢測腦內(nèi)突觸素(SYP)的活性;血凝儀測定凝血四項

7、指標;采用化學發(fā)光法測定樹鼩血清中FT3、FT4、E2、T、CORT的含量變化。
　　結果:由于樹鼩怕水不會游泳的特性，本課題以Morris水迷宮基礎上的對樹鼩行為學檢測的探索結果均無差異性，沒有統(tǒng)計學意義。故暫未探索出適合檢測樹鼩行為學的方法。高效液相色譜儀檢測結果顯示，與空白組對比，模型組樹鼩腦組織單胺類遞質(zhì)去甲腎上腺素的含量有所減少，1.92％D-半乳糖組、Aβ23-35+IBO10ug/ml組有顯著差異（P＜0.05）。經(jīng)

8、western blot檢測分析，各模型組Aβ23-35、APP、磷酸化-tau(P-tau)的條帶顏色均比空白組加深增多，其中以1.92％D-半乳糖組、Aβ23-35+IBO(10ug+5ug)組最為明顯，統(tǒng)計分析有顯著性差異(P＜0.05);D-半乳糖造模組、Aβ23-35+IBO造模組中，同組之間的高劑量與低劑量比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。HE染色病理切片結果顯示空白組未見病理形態(tài)改變，鏡下神經(jīng)元細胞結構完整，細胞未見變

9、形、固縮等改變;兩組造模組的低劑量可見海馬區(qū)神經(jīng)元細胞形態(tài)發(fā)生改變，核固縮成不規(guī)則形三角形，胞漿、胞核界限不明顯，細胞變得稀疏，錐體細胞變小、缺失;而高劑量組海馬區(qū)神經(jīng)元細胞變性壞死程度呈加重趨勢，細胞周圍間隙過大，排列紊亂，錐體細胞變小、缺失，死亡。免疫組化染色結果顯示，空白組有較多的Chat免疫陽性神經(jīng)元細胞和SYP免疫陽性神經(jīng)元細胞，細胞胞體較大且排列緊密，多為圓形或橢圓形;造模低劑量組則Chat免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，胞體縮

10、小，出現(xiàn)核固縮，排列較松散;造模高劑量組的Chat免疫陽性神經(jīng)元和SYP免疫陽性神經(jīng)元細胞形狀嚴重變形，數(shù)量較少，且神經(jīng)元細胞破裂，缺失。造模組組海馬區(qū)SYP免疫陽性神經(jīng)元細胞平均截面積、平均光密度和Chat免疫陽性細胞平均截面積、平均光密度均有所下降;與空白組比較，造模組海馬區(qū)SYP免疫陽性神經(jīng)元細胞平均截面積和Chat免疫陽性神經(jīng)元細胞平均截面積均有顯著性差異(P＜0.01)，SYP免疫陽性神經(jīng)元細胞平均光密度有顯著性差異(P＜0.

11、01)。
　　腎虛血瘀證模型:與空白組比較，造模組精神萎靡倦怠、身體蜷縮、豎毛、少動、喜臥、皮毛蓬亂無光澤，容易掉毛，體重減輕。經(jīng)血液流變儀檢測，模型1組除中切還原黏度、低切還原黏度外，其全血黏度、血漿黏度、紅細胞壓積、卡松黏度、卡松屈服應力、纖維蛋白原與空白組比較均有升高，有顯著性差異（P＜0.05）。與空白組對比，模型2組血液FT3、FT4、E2的含量降低，具有顯著性差異(P＜0.05);而模型1、2組的E2含量與空白組比較，

12、均有顯著性差異（P＜0.05）。
　　腎虛血瘀證老年癡呆樹鼩動物模型的初步建立與藥效評:與空白組比較，各造模組的樹鼩精神萎靡、倦怠，豎毛，少動，容易掉毛，體重減輕，甚至死亡。而給藥組隨著時間的延長，其精神狀態(tài)、體毛、體重、活動度漸趨于正常;相比空白組，AD病組、病證結合組、給藥組的腎指數(shù)、睪丸指數(shù)以及病證結合組的前列腺指數(shù)均有均有降低的趨勢，具有顯著性差異(P＜0.05);高效液相色譜儀檢測結果顯示，與空白組比較，病證結合組樹鼩腦

13、組織中NE的含量減少明顯，具有顯著性差異(P＜0.05);經(jīng)western blot檢測分析，AD病組、病證結合組中的Aβ23-35、APP、磷酸化-tau的條帶顏色均比空白組加深增多，其中病證結合組最為明顯，統(tǒng)計分析有顯著性差異（P＜0.05）;而給藥組條帶與空白組無明顯差異，與AD病組、病證結合組差異較大，統(tǒng)計分析有顯著差異(P＜0.05);HE染色病理切片結果顯示空白組、給藥組均未見病理形態(tài)改變，鏡下神經(jīng)元細胞結構完整，細胞核呈圓

14、形，胞漿豐富，體細胞結構連接緊密，細胞未見變形、固縮等改變;AD病組、病證結合組可見海馬區(qū)神經(jīng)元細胞形態(tài)發(fā)生改變，核固縮成不規(guī)則形，胞漿、胞核界限不明顯，細胞變得稀疏，核固縮、胞體缺失;免疫組化染色結果顯示，空白組有較多的Chat免疫陽性神經(jīng)元和SYP免疫陽性神經(jīng)元，其陽性神經(jīng)元主要存在于胞漿與包膜內(nèi)，細胞胞體較大且排列緊密，多為中等大小圓形或橢圓形;AD病組、病證結合組則Chat免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，胞體縮小，出現(xiàn)核固縮，排列較

15、松散，數(shù)量較少，且神經(jīng)元細胞破裂，缺失;與空白組比較，AD病組、病證結合組海馬區(qū)SYP免疫陽性神經(jīng)元細胞平均截面積和Chat免疫陽性細胞平均截面積均有顯著性差異(P＜0.05)，給藥組與空白組無明顯差異;血凝儀檢測結果顯示，與空白組比較，病證結合組的凝血酶原時間(PT)，AD病組、病證結合組、給藥組的活化部分凝血酶原時間(APTT)，AD病組的纖維蛋白原以及A）病組、病證結合組的凝血酶時間(TT)均有所下降，具有顯著性差異(P＜0.05

16、);與空白在比較，各造模組的FT3、T均減少，具有顯著差異性（P＜0.05），病證結合組的FT4具有顯著性差異（P＜0.05）;與給藥組比較，空白組的FT4、T、CORT無明顯差異，而AD病組、病證結合組的CORT明顯減少，具有顯著差異(P＜0.05)。
　　結論:
　　(1)以樹鼩為對象，腦室雙側大腦Meynert基底核注射Aβ+IBO復合腹腔注射氫化可的松、皮下注射腎上腺素可初步制作腎虛血瘀證老年癡呆病樹鼩動物模型;