腎陰虛型老年癡呆病證結合樹鼩動物模型的構建和六味地黃丸的藥效評價.pdf

1、目的:腎虛證是老年癡呆較常見的證型，研究腎虛型老年癡呆病及抗癡呆的中藥治療，意義重大。并且樹鼩是研究腦疾病方面較理想的實驗動物。本研究旨在以樹鼩為對象，構建腎陰虛型老年癡呆病模型，為防治老年性癡呆及相關藥物的研發(fā)提供病證結合的動物模型。
　　方法:
　　(1)腎陰虛型樹鼩動物模型的建立。摸索出氫化可的松造腎陰虛證的給藥途徑、最佳劑量、給藥時間。方法一:分別腹腔注射生理鹽水、低劑量（1mg/100g體重）氫化可的松、中劑量（1

2、.5mg/100g體重）氫化可的松、高劑量（2mg/100g體重）氫化可的松，連續(xù)5天。方法二:分別腹腔注射生理鹽水、低劑量（1mg/100g體重）氫化可的松、高劑量（1.5mg/100g體重）氫化可的松，連續(xù)7天。在造模期間每天測量樹鼩體重并觀察毛發(fā)、糞便等一般狀態(tài)。在給藥結束后，測量每組動物血清中游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、雌二醇(E2)、睪酮、皮質醇(CORT)的含量，臟器指數。
　　(2)老年癡

3、呆樹鼩動物模型的建立。方法一:分別腹腔注射生理鹽水、低劑量（0.5ml/100g體重）0.96％D-半乳糖、高劑量（0.5ml/100g體重）1.92％D-半乳糖，連續(xù)6周。6周后造模組進行雙側腦室注射鵝膏蕈氨酸(IBO)5μg，空白組在相應位置注射生理鹽水。方法二:分別雙側腦室注射生理鹽水、低劑量(Aβ25-355μg+IBO5μg)、高劑量（Aβ25-3510μg+IBO5μg）。在造模期間每天測量樹鼩體重并觀察毛發(fā)、糞便等一般狀態(tài)

4、。在給藥結束后測量臟器指數，觀察腦組織病理形態(tài)變化，比較腦組織中乙酰膽堿轉移酶(CHAT)、突觸素(SYP)、APP、Aβ1-42、磷酸化tau(P-tau)、去甲腎上腺素(NE)的含量。
　　(3)腎陰虛型老年癡呆模型的建立和六味地黃丸的干預作用。將動物隨機分成四組?？瞻捉M:第一天雙側腦室注射生理鹽水，之后腹腔注射生理鹽水連續(xù)3天，灌胃蒸餾水連續(xù)10天;AD組:第一天雙側腦室同時注射Aβ25.3510μg和IBO5μg，之后腹腔

5、注射生理鹽水連續(xù)3天，灌胃蒸餾水連續(xù)10天;腎陰虛型AD組:第一天雙側腦室同時注射Aβ25-3510μg和IBO5μg，之后腹腔注射氫化可的松（1mg/100g體重）連續(xù)3天，灌胃蒸餾水連續(xù)10天;六味地黃丸治療組:第一天雙側腦室同時注射Aβ25-3510μg和IBO5μg，之后腹腔注射氫化可的松（1mg/100g體重）連續(xù)3天，灌胃六味地黃丸（1mg/100g體重，2mg/ml）連續(xù)10天。在給藥造模期間每天測量樹鼩體重記錄一般狀態(tài)。

6、在給藥結束后，測量相應的生化指標、臟器指數、觀察腦組織的病理形態(tài)變化、比較腦組織中CHAT、SYP、APP、Aβ1-42、P-tau、NE的含量。
　　結果:
　　(1)在腎陰虛模型部分，方法一:與空白組比較，高劑量組出現肌肉萎縮，四肢瘦癟少光澤，皮膚疏松，但活動力差，狀態(tài)不好;中劑量組出現大便干結，肌肉萎縮，四肢瘦癟少光澤，皮毛無光澤，活力較強;低劑量組皮毛無光澤，生命指征良好，皮質醇水平顯著下降(p＜0.05)。方法二:

7、高劑量組出現大便干結、肌肉萎縮、四肢瘦癟少光澤、皮毛無光澤且生命體征較弱，FT3和睪酮水平均顯著下降(p＜0.05），甲狀腺指數顯著降低(p＜0.05）;低劑量組出現易驚躁動、大便干結、肌肉萎縮、皮毛無光澤，FT3和CORT水平顯著降低(p＜0.05)，E2水平顯著升高(p＜0.05)。結果表明，方法二中的低劑量(1mg/100g)，腹腔注射連續(xù)7天后，樹鼩的狀態(tài)及各項指標較符合腎陰虛證的表現。
　　(2)在老年癡呆模型部分，方法

8、一:與空白組比較，高劑量組一般狀態(tài)變化為毛發(fā)少光澤且掉毛嚴重，食盒中有糞便;腦組織中神經元細胞發(fā)生核固縮成不規(guī)則形，胞漿、胞核界限不明顯，細胞周圍間隙大，排列紊亂，神經纖維排列雜亂，錐體細胞大量缺失;CHAT免疫陽性神經元數目和SYP反應產物的量大量減少，平均截面積非常顯著下降(p＜0.01);APP、Aβ1-42、 P-tau蛋白的灰度值非常顯著性增多(p＜0.01），腦組織的NE含量顯著減少(p＜0.05）。低劑量組一般狀態(tài)變化為躁

9、動易驚，上下逃竄，毛發(fā)少光澤，掉毛，食盒中有糞便;腦組織中神經元細胞發(fā)生核固縮成不規(guī)則形，細胞稀疏，錐體細胞變小;CHAT免疫陽性神經元數量和SYP反應產物的量減少，平均截面積非常顯著降低(p＜0.01); APP、Aβ1-42、P-tau蛋白的灰度值非常顯著性增多(p＜0.01）。方法二:高劑量組一般狀態(tài)變化為毛發(fā)少光澤且掉毛嚴重，將糞便拉在食盒當中，體重顯著性降低(p＜0.05）;腦組織中神經元發(fā)生核固縮成不規(guī)則形，胞漿、胞核界限不

10、明顯，細胞周圍間隙大，排列紊亂，神經纖維排列雜亂，錐體細胞大量缺失;CHAT免疫陽性神經元數量和SYP反應產物的量大量減少，平均截面積非常顯著降低(p＜0.01)，CHAT的平均光密度非常顯著性降低(p＜0.01);APP、Aβ1-42、 P-tau蛋白的灰度值非常顯著性增多(p＜0.01);腦組織的NE含量顯著減少(p＜0.05）。低劑量組一般狀態(tài)改變不大，有輕微掉毛，體重顯著性降低(p＜0.05）;腦組織神經元發(fā)生核固縮成不規(guī)則形，

11、胞漿、胞核界限不明顯，細胞稀疏，錐體細胞變小;CHAT免疫陽性神經元數量后和SYP反應產物的量減少，平均截面積非常顯著降低(p＜0.01)，CHAT平均光密度非常顯著降低(p＜0.01);APP、Aβ1-42、P-tau化蛋白的灰度值非常顯著性增多(p＜0.01）。結果表明，1.92％D-半乳糖(0.5ml/100g體重)復合雙側腦室注射IBO5μg，雙側腦室同時注射Aβ25-3510μg和IBO5μg均能夠較好的造成老年癡呆病樹鼩模型

12、，并且雙側腦室同時注射Aβ25-35和IBO造模周期短，樹鼢死亡率低，更符合實驗要求。
　　(3)在腎陰虛老年癡呆病樹鼩動物模型的建立和六味地黃丸的干預作用部分。與空白組比較，AD組出現活動度較差，毛發(fā)少光澤，掉毛，食盒中有糞便;肝指數，脾指數，腎指數，腎上腺指數，睪丸指數均顯著性下降(p＜0.05);尿素非常顯著性升高(p＜0.01); HE染色結果，神經元形態(tài)發(fā)生改變，核固縮成不規(guī)則形、三角形，胞漿、胞核界限不明顯，細胞變得稀

13、疏，錐體細胞缺失、變小;CHAT免疫陽性神經元數量明顯減少，胞體變形，排列較松散，CHAT的平均截面積有非常顯著性降低(p＜0.01)，平均光密度有顯著性降低(p＜0.05); SYP免疫反應產物的細胞排列間隙過大，數量少，平均截面積有非常顯著性降低(p＜0.01)，平均光密度有顯著性下降(p＜0.05);在APP、 Aβ1-42、P-tau水平上均非常顯著性上升(p＜0.01); NE含量顯著性降低(p＜0.05)。腎虛AD組活動度很

14、差，肌肉萎縮嚴重，毛發(fā)少光澤，掉毛嚴重;肝指數顯著性下降(p＜0.05)，腎上腺指數非常顯著性下降(p＜0.01); FT3顯著性下降(p＜0.05);尿素和肌酐非常顯著性升高(p＜0.01);神經元形態(tài)發(fā)生改變，核固縮成不規(guī)則形、三角形，胞漿、胞核界限不明顯，細胞周圍間隙過大，排列紊亂，神經纖維排列雜亂，錐體細胞變小、大量缺失;CHAT免疫陽性神經元數量明顯減少，胞體變形，排列較松散，平均截面積有非常顯著性降低(p＜0.01)，平均光

15、密度有顯著性降低(p＜0.05);突觸素免疫反應產物的細胞排列間隙過大，數量較少，平均截面積有非常顯著性降低(p＜0.01);在APP、Aβ1-42、P-tau水平上均非常顯著性上升(p＜0.01); NE含量非常顯著性降低(p＜0.01)。與AD組比較，六味地黃丸組，FT4和CORT顯著性增多(p＜0.05)，E2顯著性下降(p＜0.05);尿素非常顯著性下降(p＜0.01); CHAT免疫陽性神經元細胞平均截面積和突觸素反應產物的平

16、均截面積有非常顯著性升高(p＜0.01);在APP、Aβ1-42、P-tau水平上均非常顯著性下降(p＜0.01)。與腎虛AD組比較，六味地黃丸組狀態(tài)體征良好，灌胃治療后毛發(fā)長出，活動度較好，食盒中無糞便;FT4顯著性增加(p＜0.05)，E2非常顯著性下降(p＜0.01);尿素和肌酐均非常顯著性下降(p＜0.01); CHAT免疫陽性神經元細胞平均截面積非常顯著性升高(p＜0.01);突觸素反應產物的平均截面積有非常顯著性升高(p＜0

17、.01);在APP、 Aβ1-42、P-tau水平上均非常顯著性下降(p＜0.01);NE含量非常顯著性升高(p＜0.01)。以上結果可認為腎陰虛型老年癡呆病的造模成功以及六味地黃丸對腎陰虛型老年癡呆病的樹鼩動物有較好的治療作用。
　　結論:腹腔注射氫化可的松，按1mg/100g體重劑量，連續(xù)給藥7天是造成腎虛證樹鼩模型的較好方法;雙側腦室基底核同時注射Aβ25-3510μg和IBO5μg，是造成老年癡呆樹鼩模型的較佳方法。雙側腦