流感病毒感染樹鼩模型的建立及樹鼩呼吸道唾液酸受體的分布研究.pdf

1、流感病毒是引起人類呼吸道疾病的重要病原體，感染后表現(xiàn)為急性呼吸道疾病，具有起病急、發(fā)病快的特點；流感嚴重危害人類健康，尤其對老年人、嬰幼兒和免疫功能低下人群，可引起致死性肺炎。采用相關動物模型來研究流感病毒發(fā)病機理和傳播方式有助于認識疾病規(guī)律和指導公共衛(wèi)生管理，但是目前已有的流感動物模型存在一定的不足，我們需要尋找更具臨床模擬性的良好動物模型。樹鼩是形似松鼠的小型哺乳動物，它在生物學特征、新陳代謝、生理生化和基因組等方面與人類近似，被認

2、為是有望代替靈長類動物的新型實驗動物。目前，樹鼩已被廣泛用于生命科學研究，尤其是作為人類疾病動物模型，包括病毒感染性疾病、神經系統(tǒng)疾病、腫瘤等疾病模型。
　　【目的】：
　　本論通過觀察樹鼩被流感病毒感染后的癥狀表現(xiàn)、病毒復制力、組織器官病理特征、體液免疫、固有免疫反應等建立穩(wěn)定的流感樹鼩模型；初步探索樹鼩呼吸道組織唾液酸受體及受體轉移酶的分布。
　　【方法】：
　　1．流感病毒感染樹鼩以觀察癥狀及排毒：選取30

3、只無中和抗體的成年樹鼩，戊巴比妥鈉麻醉后，滴鼻接種甲型流感病毒（人H1N1流感病毒和禽H9N2流感病毒）（>106TCID50）200μl/只，每組15只；感染前3天至感染后14天，每天監(jiān)測樹鼩體溫，記錄體重（n=5）；感染后第3、6天進行鼻灌洗，采用細胞病變法（CPE法）測定鼻灌洗液的病毒滴度。
　　2．流感病毒（H1N1）感染樹鼩以觀察組織器官的病理特征、體液免疫、固有免疫反應：選取16只無中和抗體的成年樹鼩，戊巴比妥鈉麻醉后

4、，其中12只滴鼻感染流感病毒（H1N1）（>106TCID50）200μl/只，4只滴鼻等量的病毒液溶劑。感染后第2、4、6天使用戊巴比妥鈉麻醉樹鼩，心臟采血后（n=4）在無菌環(huán)境下解剖樹鼩取得鼻甲骨、氣管和肺組織，部分勻漿用于提取RNA檢測細胞因子和趨化因子在 mRNA水平的表達含量；另一部分固定、切片進行 HE染色觀察組織病理變化以及進行免疫組化實驗；第14天麻醉后心臟采血通過微量中和實驗評價血清中和抗體效價。
　　3、流感病

5、毒感染體外培養(yǎng)的樹鼩原代組織：無菌環(huán)境下取得肺、氣管和鼻甲骨等組織；剪成約2mm×2mm大小的組織塊，加入F-12K培養(yǎng)液置于37℃培養(yǎng)。取材后3小時內分別感染106 TCID50的H1N1、H3N2、H9N2流感病毒；2h后棄去病毒液，以PBS洗3次，換為含1.5μg/mlTPCK胰酶的新鮮F-12K培養(yǎng)基，34℃培養(yǎng)，在感染后1,24,48和72h取上清進行病毒載量測定，組織勻漿提取RNA以檢測細胞因子和趨化因子在mRNA水平的表達

6、含量。
　　4、采用免疫組織化學的方法對樹鼩肺和上氣道中的唾液酸受體和受體轉移酶進行染色以探討唾液酸受體及轉移酶在樹鼩呼吸道組織中的分布。
　　【實驗結果】：
　　1、癥狀表現(xiàn)：感染人H1N1流感病毒和禽H9N2流感病毒的樹鼩均在感染后第3、4天出現(xiàn)體溫升高，平均可上升1℃左右。感染人H1N1流感病毒的樹鼩體重下降，尤其在感染后第2~6天體重下降幅度較大，最大下降幅度約14％，隨后體重緩慢回升；而感染禽H9N2流感病毒

7、的樹鼩體重沒有明顯變化。
　　2、病毒復制力：滴鼻感染H1N1和H9N2的樹鼩在第3天和第6天的鼻灌洗液中都可檢測出具有感染力的病毒。樹鼩的鼻甲骨、氣管和肺組織在體外均可被流感病毒感染并成功復制，采用細胞病變法得病毒滴度范圍為在102.25TCID50~105.5TCID50之間，感染后48h病毒復制達高峰。
　　3、病理及免疫組化：病理切片HE染色顯示感染H1N1流感病毒后樹鼩的鼻甲骨、氣管和肺組織出現(xiàn)明顯的炎癥細胞滲出、

8、肺間質增寬等現(xiàn)象；免疫組化結果顯示樹鼩鼻甲骨存在流感病毒抗原。
　　4、固有免疫：樹鼩體內感染H1N1流感病毒后上呼吸道組織部分細胞因子和趨化因子在 mRNA水平的表達上調；體外感染流感病毒也可以激發(fā)樹鼩的呼吸道組織產生免疫反應，病毒相關炎癥因子 IL-6、TNF-a、IL-8、IL-10、RANTES、MIG、IFN-β在mRNA水平上的表達呈不同程度升高。
　　5、體液免疫：感染前和感染后第14天雙份血清中和抗體結果顯示

9、感染流感病毒后樹鼩血清中和滴度升高，最高滴度達446.7倍。
　　6、受體分布：樹鼩鼻甲骨同時表達Siaα2,6和Siaα2,3受體，氣管主要表達Siaα2,6受體，同時表達少量Siaα2,3受體，而肺組織中兩種受體均不表達。上氣道只表達Siaα2,6酶，Siaα2,3和Siaα2,6酶同時表達于下氣道，肺組織主要表達Siaα2,3酶。
　　【實驗結論】：
　　流感病毒可感染樹鼩，在樹鼩呼吸道組織內進行有效復制，能一定