人流感病毒感染缺乏α-2,6唾液酸受體的胎鼠大腦皮層神經元研究.pdf

1、背景和目的：
　　傳統(tǒng)觀點認為，流感病毒是通過其病毒外殼上的血凝素（Hemagglutinin,HA），結合到宿主細胞膜上的唾液酸受體，而作為感染的起始步驟。早期研究發(fā)現(xiàn)，人流感病毒結合α-2,6唾液酸受體，而禽流感表達則結合α-2,3唾液酸受體。流感病毒唾液酸受體可以使用植物凝集素SNA、MAAⅠ、MAAⅡ進行染色鑒定。SNA結合人流感病毒受體α-2,6唾液酸，MAAⅠ、MAAⅡ則結合禽流感病毒受體α-2,3唾液酸。但是一些最近

2、的研究結果發(fā)現(xiàn)，存在流感病毒對細胞的感染與細胞唾液酸受體的分布并不一致的現(xiàn)象。
　　流感病毒感染除了導致呼吸系統(tǒng)疾病外，關于流感相關腦病和腦炎亦有報道。研究結果表明流感病毒可通過感染外周神經系統(tǒng)和通過呼吸道嗅神經-嗅球的途徑感染中樞神經系統(tǒng)。但是經典的流感病毒受體在神經元上是否表達以及流感病毒感染神經元的感染機制還有待深入研究。
　　本研究建立了胎鼠大腦皮層神經元細胞模型，使用神經氨酸酶消化神經元膜上的唾液酸后，驗證了植物凝

3、集素染色的特異性。然后，通過植物凝集素的特異性染色，鑒定神經元細胞上流感病毒受體的表達情況，并且使用人流感病毒毒株感染原代培養(yǎng)的小鼠神經元，以觀察分析人流感病毒在該神經元內的感染情況。
　　材料與方法：
　　神經元的原代培養(yǎng)：取孕16-18天的C57BL/6胎鼠大腦皮層，經木瓜蛋白酶消化以及機械吹打，接種于Neurobasal+B27培養(yǎng)基中，>90％的神經元培養(yǎng)8天后神經元成熟用于后續(xù)實驗。
　　尼氏染色鑒定神經元：

4、通過甲苯胺藍對神經元特異性尼氏小體進行特異性染色，鑒定神經元。
　　免疫熒光法檢測神經元純度：使用免疫熒光法，通過特異性抗體，檢測神經元特異性蛋白微管相關蛋白2（MAP2），對神經元進行染色鑒定，并使用DAPI染細胞核，通過計數(shù)神經元細胞數(shù)（MAP2陽性）以及總細胞數(shù)（DAPI陽性），計算原代培養(yǎng)的神經元陽性細胞率。
　　植物凝集素染色特異性的確定：使用神經氨酸酶消化神經元，然后再使用植物凝集素（SNA、MAAⅠ和MAAⅡ）

5、進行染色，若染色結果為陰性，則表明植物凝集素是特異性地結合唾液酸受體的。
　　植物凝集素染色研究唾液酸受體表達情況：使用SNA、MAAⅠ和MAAⅡ三種植物凝集素孵育神經元細胞，經辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素結合后，AEC顯色。
　　人流感病毒感染神經元：本實驗使用兩株人流感病毒A/Nanchang/8002/2009(H1N1)和A/brisbane/59/2007(H1N1)對培養(yǎng)的神經元進行感染，分別在感染后的不同時間

6、點收集感染的神經元，以檢測流感病毒在其中的復制情況。
　　流感病毒RNA在神經元內的表達：提取感染后的神經元總RNA，逆轉錄后使用熒光實時定量PCR的方法檢測流感病毒保守基因基質蛋白的表達情況，進而分析流感病毒在神經元內病毒RNA的復制情況。
　　流感病毒蛋白在神經元內的表達：提取感染后的神經元總蛋白，使用免疫印跡檢法測流感病毒核蛋白在感染的神經元內的蛋白表達情況。
　　免疫熒光法檢測流感病毒在神經元內的定位：將神經元

7、與用流感病毒M1蛋白抗體孵育，用已感染的神經元細胞爬片進行免疫熒光檢測，觀察流感病毒在神經元細胞內的定位。
　　TCID50法檢測子代病毒釋放：收集感染后的上清，用TCID50法檢測子代病毒的釋放。
　　結果：
　　通過原代神經元培養(yǎng)細胞的植物凝集素染色結果顯示，SNA信號呈陰性反應，表明胎鼠神經元不存在人流感病毒α-2,6唾液酸受體。相反，MAAⅠ和MAAⅡ染色均呈細胞膜上陽性反應，也就表明胎鼠神經元膜上存在著禽流感

8、病毒α-2,3唾液酸受體。然而，經用神經氨酸酶消化后的神經元，植物凝集素染色結果均為陰性，表明SNA、MAAⅠ和MAAⅡ三種植物凝集素對唾液酸受體染色均為特異性的。
　　使用兩株人流感病毒感染胎鼠神經元培養(yǎng)細胞，分別在感染6小時，12小時，24小時后收集已感染的神經元，提取RNA，檢測流感病毒RNA表達水平的變化。結果表明，流感病毒隨時間的延長，其RNA在神經元內的表達量隨之上升。同樣，使用免疫印跡檢測流感病毒核蛋白的表達情況，結

9、果顯示流感病毒核蛋白在感染的神經元內其表達水平與病毒RNA的表達水平呈相似的上升趨勢。另外，運用免疫熒光檢測流感病毒在神經元內M1蛋白的情況，兩株流感病毒的M1蛋白均能在感染24小時后檢測到。感染后6-48小時子代病毒的釋放呈上升趨勢。
　　結論：
　　1.分離培養(yǎng)的胎鼠大腦皮層神經元細胞存在禽流感病毒α-2,3唾液酸受體，不存在人流感病毒α-2,6唾液酸受體；
　　2.成功建立流感病毒感染神經元細胞的模型；