鼻咽癌超微結(jié)構(gòu)及Ki-67、p53表達的定量分析與診斷預后的關(guān)系.pdf

1、鼻咽癌(nasophatyngeal carcinoma,NPC)是我國華南地區(qū)常見惡性腫瘤之一。廣東、廣西、湖南、福建等南方各地發(fā)病率較高,占鼻咽部惡性腫瘤的92％(1)。NPC的病理類型:(1).非角化性癌(未分化型,分化型,混合型)；(2)角化性鱗狀細胞癌。NPC早期診斷較難。體視學理論與圖像分析技術(shù)面向醫(yī)學臨床應用是目前國內(nèi)外從事生物醫(yī)學圖像分析專家及病理學醫(yī)生積極探索解決、希望能有所突破的問題之一。本實驗通過對NPC細胞株、N

2、PC組織、鼻咽部正常粘膜上皮、鼻咽部慢性炎癥粘膜上皮的超微結(jié)構(gòu)研究,力求揭示NPC細胞體視學超微結(jié)構(gòu)特點、對NPC細胞進行量化診斷。
　　 Ki-67是發(fā)生在增殖細胞中表達的一種核抗原,Ki67的表達局限于細胞周期的G1期到M期,參與細胞有絲分裂,其陽性表達高低與細胞增殖活性密切相關(guān)。廣泛應用于評估腫瘤細胞的增值活性,因此可作為評價細胞增殖狀態(tài)、評估腫瘤的預后和判斷惡性腫瘤遠隔臟器轉(zhuǎn)移危險性的重要指標。關(guān)于Ki67的表達與腫瘤預

3、后的關(guān)系研究較多,多數(shù)研究提示Ki67的表達與腫瘤分化程度呈正相關(guān),而與腫瘤的臨床分期、是否伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、瘤體大小的關(guān)系在不同類型腫瘤中的研究結(jié)果不盡相同。多數(shù)學者認為Ki-67表達的高低與腫瘤的組織類型、分化程度及預后有關(guān)。目前國內(nèi)有關(guān)Ki-67與NPC的文獻報道較少。
　　 P53基因是一種廣譜的抑癌基因,p53基因通過其產(chǎn)物p53蛋白實現(xiàn)對細胞周期的調(diào)控。P53蛋白只在人鼻咽癌組織中和癌旁不典型增生的上皮有表達,而在鼻咽

4、正常組織中無表達。提示p53蛋白的過表達可能與人鼻咽癌的發(fā)生有密切的關(guān)系,p53蛋白陽性可作為鼻咽癌診斷的參考指標。國內(nèi)外有關(guān)p53蛋白在結(jié)腸癌、直腸癌、乳腺癌、肺癌中表達的研究較多,p53蛋白在各種腫瘤的表達情況有所差別。以上文獻報道均采用半定量的方法。
　　 目的和意義
　　 1.探討NPC細胞的超微結(jié)構(gòu)特征,為臨床診斷NPC提供臨床病理學診斷依據(jù)。
　　 2.定量分析Ki-67、p53蛋白在iNPC組織中的

5、表達,從量化角度揭示其在NPC組織中表達的病理學意義。
　　 3.觀察Ki-67、p53蛋白在NPC中的表達,從定量和半定量兩方面探討Ki-67、p53蛋白與NPC預后的關(guān)系,為臨床分析NPC預后提供一定的病理學依據(jù)。
　　 材料和方法
　　 一.鼻咽癌超微結(jié)構(gòu)分析
　　 實驗材料:病例來自我校南方醫(yī)院和珠江醫(yī)院門診及三九腦科醫(yī)院門診,所選標本是耳鼻喉科門診鼻咽癌診室醫(yī)生鉗取(鼻咽鏡下)的新鮮鼻咽癌組織,

6、共取疑似鼻咽癌最后病理論斷為慢性炎癥患者的炎性上皮12例,20例鼻咽癌患者的正常鼻咽上皮、鼻咽癌組織,共計52例標本。癌組織經(jīng)病理確診為非角化性鼻咽癌14例和角化性鱗狀細胞癌6例(包括高分化鱗癌、低分化鱗癌)。納入病例要求被取活檢的鼻咽癌患者均未經(jīng)任何抗腫瘤治療(放、化療),且為臨床首次被確診的鼻咽癌患者。鼻咽癌細胞株(5-8F和CNE-1)為南方醫(yī)科大學腫瘤研究所保存細胞系。
　　 實驗方法:新鮮標本采集后,離體后一分鐘內(nèi)切成

7、大小為1～2mm3組織塊三到五塊,取材的刀片要鋒利,低溫操作,通常為4℃,1min內(nèi)入2.5％戊二醛電鏡固定液前固定,4℃固定2～4h,漂洗；后固定1.5～2h,漂洗；脫水；置換；浸透；包埋；在解剖顯微鏡下修塊；半薄切片；HE染色；在解剖顯微鏡下和普通顯微鏡下定位；超薄切片；電子染色；干燥后電鏡觀察。攝片后測試細胞核的周長(Cn)、面積(An)、體積(v11)、體積密度(Vvn)、數(shù)密度(Nvn)、表面積密度(Svn),細胞的周長(Cc

8、)、面積(Ac)共8個結(jié)構(gòu)參數(shù)
　　 統(tǒng)計學分析:采用SPSS 13.0軟件,對正常鼻咽上皮、鼻咽部慢性炎癥上皮、鼻咽癌組織以及鼻咽癌細胞株(5-8F和CNE-1)的細胞和細胞核所測得的結(jié)構(gòu)參數(shù)值進行單因素方差分析、組間的兩兩比較分析(L SD法)以及兩組間采用獨立樣本t檢驗。
　　 二.Ki-67和p53在鼻咽癌中的定量表達及其與診斷預后的關(guān)系
　　 實驗材料和分組:收集南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院病理科2000年

9、1月至2005年12月經(jīng)常規(guī)HE切片后確診為鼻咽癌(NPC)的活檢標本79例,平均年齡47.00±11.72(14～70歲)；其中男性63例,平均年齡47.24±12.23(14～70歲)；女性18例,平均年齡46.12±9.89(27～67歲)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的37例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的42例:有遠處轉(zhuǎn)移的24例,無遠處轉(zhuǎn)移的55例；TNM分期Ⅰ期～Ⅱ期20例,Ⅲ期34例,Ⅳ期25例。以上病例均有較完整的臨床資料和5年以上的隨訪結(jié)果,并且均

10、為首診、未經(jīng)任何治療的鼻咽癌患者標本。患者納入標準:1.納入標準:本院附屬醫(yī)院病理科2000-2005經(jīng)病理活檢確診為鱗狀細胞癌；2.首次就診；3.治療前活檢標本完好；4.隨訪5年以上；5.病歷資料完整。
　　 實驗方法:采用免疫組織化學技術(shù)檢測Ki-67和p53蛋白在鼻咽癌中的表達情況,用Leica Q500 MC圖像分析系統(tǒng)測試Ki-67和p53蛋白的陽性單位(PU)值,定量分析Ki-67和p53在鼻咽癌中的表達及基于量化改

11、變的變化規(guī)律,分析其與臨床特征和生存時間的關(guān)系。
　　 統(tǒng)計學分析:應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行處理。各組實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(x±s)表示。采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,組間多重比較采用LSD法。以P<0.05表示差異具有顯著性。應用Spearman法分析Ki-67、p53陽性細胞率與鼻咽癌患者生存時間之間的關(guān)系。采用Kaplan-Meier法進行生存分析,顯著性檢驗采用Log rank法,

12、對預后因素采用COX回歸分析。
　　 結(jié)論
　　 1.鼻咽癌細胞與鼻咽正常上皮、炎性病變上皮細胞的定量測試結(jié)果表明,鼻咽癌細胞及核的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的改變,其病理發(fā)展過程存在一個由正常鼻咽上皮→異型增生→癌變的漸進過程；因此在鼻咽癌的診斷分析中,可以用鼻咽癌細胞及核的結(jié)構(gòu)參數(shù)值對鼻咽正常上皮細胞、異型增生上皮細胞及癌細胞進行判別分析。
　　 2.Ki-67蛋白表達程度與NPC遠處轉(zhuǎn)移、患者生存時間及TNM分期相關(guān)；K

13、i67陽性細胞率與患者生存時間相關(guān)。臨床分期高、伴有遠處轉(zhuǎn)移、生存期短的患者其Ki-67蛋白PU值大,Ki-67蛋白表達強.Ki-67細胞陽性率越高,NPC患者生存時間越短；Cox回歸模型(Cox regression)多因素生存分析顯示:Ki67陽性細胞率是影響鼻咽癌患者預后的獨立影響因素(BE=5.67、P=0.034)。結(jié)果表明,Ki67陽性細胞率每增加十個百分點,鼻咽癌患者的死亡率就增加5.67倍。
　　 3.p53蛋白