幾種主要海洋經(jīng)濟簾蛤種質(zhì)鑒定及種群遺傳結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、采用不連續(xù)垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，對文蛤(Meretrix meretrix L．1758)、青蛤(Cyclina sinensis G，1791)、硬殼蛤(Mercenaria mercenaria L.，1758)和菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum A.，1850)的4種組織(肝、鰓、后閉殼肌和外套膜)的酯酶(EST)、蘋果酸脫氫酶(MDH)和超氧化物歧化酶(SOD)同工酶進行了研究。結(jié)果表明，不同簾

2、蛤的同工酶譜有明顯的差異；同種簾蛤不同組織間的EST和MDH同工酶有一定的組織特異性；EST和MDH同工酶位點豐富，可用于不同物種的鑒定；肝、鰓EST和閉殼肌MDH酶活性較高，是進行同工酶分析的理想材料。 對硬殼蛤5種組織(足、外套膜、閉殼肌、鰓和肝)的酯酶(EST)、蘋果酸脫氫酶(MDH)和乳酸脫氫酶(LDH)同工酶進行了比較研究，并對酶譜表型及位點表達進行了分析。結(jié)果表明，硬殼蛤上述組織的EST和MDH同工酶存在不同程度的組

3、織特異性，而LDH沒有組織特異性。在EST酶譜中，肝組織染色最深，說明其EST活性最高，這與肝臟是重要的消化腺和解毒器官相適應。在MDH酶譜中發(fā)現(xiàn)了s．MDH和m-MDH所形成的譜帶，閉殼肌的MDH譜帶染色很深，這與肌肉需要由三羧酸循環(huán)提供大量ATP相適應。 2.4種簾蛤群體遺傳多樣性和種間關系及文蛤4個地理種群遺傳結(jié)構(gòu)的 fhFLP分析 利用熒光標記擴增片段長度多態(tài)性(fAFLP)技術對4種簾蛤(文蛤、青蛤、菲律賓蛤

4、仔和硬殼蛤)的群體遺傳多樣性和種間關系進行了研究。選擇EcoR I／Mse I進行酶切，使用6個E+3／M+3引物組合進行擴增，共獲得1096個位點，多態(tài)位點比率95.1％，片段長度50-456bp。其中，文蛤、青蛤、菲律賓蛤仔和硬殼蛤分別得到681、715、702和694個位點，各物種相應的多態(tài)位點比率為76.8％、81.7％、83.0％和75.1％，得到17個物種特異性位點，可作為4物種特征標記。分析了群體遺傳相似系數(shù)和遺傳多樣性指

5、數(shù)以及種間遺傳相似系數(shù)。結(jié)果表明，硬殼蛤群體遺傳相似系數(shù)最高(0.6709)，遺傳多樣性指數(shù)最低(0.2360)；菲律賓蛤仔群體遺傳相似系數(shù)最低(0.5925)，遺傳多樣性指數(shù)最高(0.2618)。根據(jù)遺傳相似系數(shù)采用UPGMA法構(gòu)建了4物種的聚類圖，表明文蛤與菲律賓蛤仔遺傳關系最近，青蛤與其他3物種遺傳關系較遠。使用3個E+3／M+3引物組合，對連云港、大連、湛江和防城港4個地理種群文蛤的遺傳結(jié)構(gòu)進行了研究，共檢測到329個位點，多態(tài)

6、位點比率分別為76.7％、74.5％、73.5％和75.2％；種群內(nèi)遺傳相似系數(shù)分別為0.6193、0.6331、0.6577和0.6411，遺傳多樣性指數(shù)分別為0.2428、0.2347、0.2216和0.2232，以連云港文蛤多態(tài)位點比率和遺傳多樣性指數(shù)最高，種群內(nèi)遺傳相似系數(shù)最低，表明連云港文蛤具有更豐富的遺傳多樣性水平，但4個種群間差異不大。連云港、大連和湛江文蛤種群間遺傳相似系數(shù)與各自種群內(nèi)的遺傳相似系數(shù)沒有顯著差異，說明3種

7、群遺傳分化不明顯，推測造成這一現(xiàn)象的原因是：大連和湛江近期發(fā)生過從連云港或江蘇引種事件，從而引起3種群的基因交流，但還需要進一步的證據(jù)。聚類分析表明，防城港種群與其他3種群首先分開，表現(xiàn)出一定的遺傳分化?？偟膩碚f，我國不同地區(qū)的文蛤遺傳多樣性水平較高，遺傳改良潛力仍然很大。 3．簾蛤科貝類rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)及5.8S rRNA基因序列研究 應用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增了文蛤、青蛤、硬殼蛤、江戶布目蛤(Prototh

8、acajedoensis L.，1874)、薄片鏡蛤(Dosinia corrugata R.，1850)和菲律賓蛤仔6種簾蛤的第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1)和第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS2)序列，并進行了測序。結(jié)果表明，6種簾蛤ITS1序列長度522-900bp，是迄今已報道雙殼貝類中變化范圍最大的，GC含量57.66％-65.62％；ITS2序列長度281-412bp，GC含量65.21％-67.87％。6種簾蛤ITS1和ITS2序列種間

9、差異很大，有明顯的長度多態(tài)性，ITS2種間序列相似度高于ITS1。通過對ITS1和ITS2序列的組裝獲得了6種簾蛤5.8S rRNA基因完整序列，序列全長均為157bp。以ITS2序列(包含5.8S和28S rRNA基因部分序列)為標記，用北極蛤科的Arctica islandica相應序列數(shù)據(jù)作外群，構(gòu)建了簾蛤科貝類的系統(tǒng)發(fā)育樹，其拓撲結(jié)構(gòu)顯示同屬雪蛤亞科的江戶布目蛤與硬殼蛤親緣關系最近。 采用ITS序列對文蛤種群遺傳結(jié)構(gòu)進行

10、了研究，文蛤4個地理種群8個測序個體共發(fā)現(xiàn)5個ITS1單倍型，ITS1序列5’端存在串聯(lián)重復和微衛(wèi)星序列，它在不同群體中的重復次數(shù)不同，從而造成ITS1序列長度變化很大，種群間序列差異度最大達3.6％，由于文蛤ITS1中存在串聯(lián)重復序列，且ITS1長度較大不利于測序，限制了其在種群遺傳結(jié)構(gòu)研究中的應用。相比較，ITS2序列長度適中且變化很小，適合進行種群遺傳結(jié)構(gòu)研究，4個地理種群48個測序樣品共發(fā)現(xiàn)15個ITS2單倍型，聚類分析表明，連

11、云港、大連和湛江種群的單倍型間沒有形成單獨的分枝，存在交叉，而防城港種群雖未單獨聚為一枝，但與其他3種群分開，這與fAFLP分析的結(jié)果是一致的。4.6種簾蛤和4個地理種群文蛤線粒體COI基因片段序列分析對文蛤、青蛤、硬殼蛤、江戶布目蛤、薄片鏡蛤和菲律賓蛤仔6種簾蛤和4個地理種群文蛤(大連、連云港、湛江和防城港)的細胞色素c氧化酶亞基I(COI)基因片段序列進行了分析，以探討這一序列在種質(zhì)鑒定、種群遺傳結(jié)構(gòu)和分子系統(tǒng)發(fā)育研究中的應用價值。

12、測序結(jié)果表明，所有物種擴增片段長度均為709bp，序列A+T含量(62.2％-67.6％)明顯高于GC含量。物種間共有變異位點311個，其中簡約信息位點202個，全部為轉(zhuǎn)換或顛換，堿基的替換位置主要發(fā)生在密碼子的第三位；種間堿基差異度較大為20.2％-32.6％，因此，支持簾蛤科設亞科分類階元的觀點；此區(qū)段共編碼235個氨基酸，種間共有氨基酸變異位點85個。以COI基因片段序列為標記，用竹蟶科的大竹蟶相應序列數(shù)據(jù)作外群，構(gòu)建了簾蛤科貝類

13、的系統(tǒng)發(fā)育樹，其拓撲結(jié)構(gòu)顯示4個地理種群文蛤首先聚為1個單元，然后與青蛤聚在一起，最后所有簾蛤科物種聚為一枝，與外群相區(qū)別?；贑OI序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹與傳統(tǒng)形態(tài)分類與一定差別，硬殼蛤沒有與同一亞科的江戶布目蛤聚在一起，而是首先與鏡蛤亞科的薄片鏡蛤聚為一枝，這與基于ITS2分析的結(jié)果不同。采用COI序列對文蛤種群遺傳結(jié)構(gòu)進行了研究。文蛤4個地理種群40個測序個體共發(fā)現(xiàn)15個COI單倍型，其中連云港WL2與大連WD1兩個單倍型序列相同，為共

14、享單倍型。種群間有51個變異位點，其中，轉(zhuǎn)換50處，顛換1處。堿基替換主要出現(xiàn)在防城港種群與其他種群之間，種群內(nèi)變異位點較少。不同單倍型之間序列差異百分比0.0-7.1％，防城港種群與其他種群間差異較大，大連、連云港及湛江3個種群間差異較小。在51個變異位點中，10個發(fā)生在密碼子的第一位，41個發(fā)生在密碼子的第三位，但由于密碼子的兼并性，發(fā)生在密碼子第三位的變異全部不引起編碼氨基酸的改變(同義突變)，而發(fā)生在密碼子第一位的變異，只有1處