依達拉奉對腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、背景：腦梗死是目前危害人類健康的常見疾病，致殘率、病死率高。人們對于急性缺血性腦血管病的發(fā)病機制研究已久，但預(yù)后仍然很差。臨床上仍缺乏療效確切、被廣泛認可的腦保護劑。急性腦梗死病灶由中心壞死區(qū)及周圍的缺血半暗帶組成。半暗帶由于存在側(cè)枝循環(huán)，尚有大量可存活的神經(jīng)元，盡快恢復(fù)血供、保護這些可逆性損傷的神經(jīng)元是腦梗死的治療關(guān)鍵。但是再灌注本身可能加重缺血所致的損傷，稱為缺血-再灌注(I-R)損傷。目前認為自由基的作用是缺血-再灌注損傷的重要發(fā)

2、病學(xué)環(huán)節(jié)，有資料表明，自由基對腦缺血組織損傷依賴于缺血后再灌注，即在重新給氧的情況下，自由基的生成比在單純?nèi)毖闆r下要大大增加，有效清除自由基是減輕腦缺血再灌注損傷的靶點之一。隨著科學(xué)的發(fā)展，抗自由基保護劑在腦缺血再灌注損傷過程中所起的作用越來越引起人們的注意。其中依達拉奉對再灌注損傷中腦組織的保護作用尤其引起學(xué)者們的關(guān)注，臨床應(yīng)用前景廣泛。依達拉奉是一種新研發(fā)的自由基清除劑，動物實驗和臨床研究均顯示其有效的腦保護作用。但研究大都集中整

3、體實驗動物水平以及臨床患者癥狀體征指標的檢測方面，缺乏確切的分子細胞水平的研究證據(jù)。因此，進一步明確其保護作用發(fā)生的分子機制有著重要意義，可為臨床早期使用自由基清除劑、改善預(yù)后，提供可靠的理論基礎(chǔ)。 目的：通過將沙土鼠制成腦缺血再灌注模型，用依達拉奉干預(yù)后，在整體水平上探討依達拉奉的保護作用。檢測其腦組織勻漿中丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性，探討依達拉奉對脂質(zhì)過氧化的影響。并用電鏡、免疫組化檢測腦組織切片中神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)和凋亡

4、情況。原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細胞，模擬缺血再灌注損傷，在細胞水平探討依達拉奉對脂質(zhì)過氧化、神經(jīng)元游離Ca2+濃度和線粒體膜電位的影響，以及對早期、晚期細胞凋亡的作用。為自由基清除劑依達拉奉的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法：1.在整體動物實驗水平上，依達拉奉對腦缺血再灌注損傷的保護作用研究。 (1)建立沙土鼠全前腦缺血再灌注損傷模型，用動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈10min后，松開動脈夾形成再灌注。沙土鼠隨機分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注

5、組(模型組)、腦缺血再灌注加依達拉奉干預(yù)組(依達拉奉組)。依達拉奉組在再灌注當時給予依達拉奉10mg/kg腹腔注射。模型組注射等量生理鹽水，假手術(shù)組除不夾閉頸總動脈，余過程同模型組。每組按再灌注時間3h，6h，12h，24h，48h，72h分6個亞組，觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化。 (2)將沙土鼠在再灌注各個時間點斷頭取腦，制備10﹪腦組織勻漿，檢測腦組織勻漿中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，反映依達拉奉的抗脂質(zhì)過氧

6、化作用和清除自由基水平。 (3)在再灌注各個時間點取海馬組織制成透射電鏡標本，電鏡下觀察海馬CAl區(qū)細胞超微結(jié)構(gòu)和凋亡情況。 (4)通過免疫組化的方法，TUNEL染色檢測各組沙土鼠海馬CAl區(qū)細胞原位凋亡情況。 2、在離體實驗細胞水平上，探討依達拉奉對腦缺血再灌注損傷的保護作用 (1)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細胞，建立模擬缺血再灌注損傷模型，分為正常細胞組(不加任何干預(yù)措施)、缺氧復(fù)氧組(將海馬神經(jīng)元缺氧培養(yǎng)2

7、h，復(fù)氧24h)、依達拉奉干預(yù)組(復(fù)氧當時分別給予1、10、100、300μmol/L依達拉奉干預(yù))和陽性參照藥維生素C干預(yù)組(復(fù)氧當時給予l00umol/L維生素C干預(yù))，檢測細胞培養(yǎng)上清中MDA、SOD含量。 (2)將各組海馬神經(jīng)元細胞用鈣離子敏感性染料Fluo-3AM和線粒體膜電位敏感性染料Rhodamine-123進行染色后，激光共聚焦顯微鏡分別檢測細胞內(nèi)游離鈣離子濃度和線粒體膜電位。 (3)采用AnnexinV

8、/PI雙染法和DNA含量測定法用流式細胞儀檢測依達拉奉對各組海馬神經(jīng)元模擬缺血再灌注損傷后細胞早期凋亡和晚期凋亡的影響。 結(jié)果：1.依達拉奉對沙土鼠前腦缺血再灌注損傷的保護作用(1)沙土鼠前腦缺血再灌注損傷模型中，在各個時間點，假手術(shù)組SOD活性無顯著性差異，缺血再灌注損傷后SOD活性下降，模型組SOD活性明顯低于假手術(shù)組(p＜0.05)，在缺血再灌注3h即可見SOD活力下降，給予依達拉奉干預(yù)能明顯提高SOD活力，依達拉奉組在每

9、個時間點SOD活力均高于模型組(p＜0.05)。 (2)假手術(shù)組MDA含量在各個時間點無明顯變化。缺血再灌注損傷后，模型組再灌注3hMDA含量即上升(1.94±0.15nmol/mg.prot)，隨再灌注時間延長，MDA持續(xù)升高(72h高達4.51士0.45nmol/mg.prot)。依達拉奉干預(yù)能有效地降低MDA水平，依達拉奉組在各時間點MDA含量均較模型組低(3h：1.54±0.32nmol/mg.prot，72h：3.07

10、±0.34nmol/mg.prot，p＜0.05)。 (3)透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)變化：假手術(shù)組海馬CAl區(qū)錐體細胞基本沒有損傷表現(xiàn)，胞膜完整，胞質(zhì)內(nèi)線粒體內(nèi)嵴排列整齊、清晰，胞核形態(tài)規(guī)則，核膜完整；染色質(zhì)疏松均勻。再灌注24h以后損傷明顯加重，出現(xiàn)凋亡改變。細胞膜、核膜不完整，核膜部分皺褶，核質(zhì)不均勻，染色質(zhì)聚集靠邊，附于核膜，線粒體斷裂或消失。缺血再灌注損傷給予依達拉奉干預(yù)組的損傷較相同時間點未加依達拉奉干預(yù)組程度輕。

11、 (4)TUNEL染色計數(shù)海馬CAl區(qū)錐體細胞凋亡情況：假手術(shù)組海馬CAl區(qū)TUNEL染色細胞凋亡不明顯，缺血再灌注損傷6h，12h染色陽性細胞開始增多，24h，48h，72h均見大量TUNEL染色陽性細胞，缺血再灌注損傷+依達拉奉組TUNEL染色陽性細胞數(shù)明顯減少，在各時間點與單純損傷不加依達拉奉干預(yù)組相比均存在顯著性差異。 2.依達拉奉對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細胞模擬缺血再灌注損傷的保護作用 (1)海馬神經(jīng)元在正常生

12、長狀態(tài)下脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量為0.57±0.08nmol/ml，SOD活性54.36±5.58U/ml。H/R損傷后，海馬神經(jīng)元內(nèi)MDA含量增高(1.47±0.15nmol/m1)，SOD活性下降(26.40±3.77U/m1)，表明細胞內(nèi)清除氧自由基的能力下降，脂質(zhì)過氧化程度增加。用100μmol/L和300μmol/L依達拉奉干預(yù)均能有效地增高細胞內(nèi)SOD活性(兩組細胞中SOD活性分別為48.11±5.54U/ml，47.32±

13、5.82U/m1)，降低MDA含量(兩組細胞中MDA含量分別為0.87±0.11nmol/ml，0.90±0.13nmol/m1)。 (2)與正常對照組比較，缺氧復(fù)氧組(H/Rcontr01)細胞內(nèi)鈣離子濃度增加81﹪(P＜0.01)。缺氧復(fù)氧加依達拉奉1，10μmol/L組(1，10μM組)和維生素C(VC)組對胞內(nèi)鈣離子濃度無明顯影響(P＞0.05)。與H/Rcontrol組比較，缺氧復(fù)氧加依達拉奉100，300μmol/L

14、組的胞內(nèi)鈣離子濃度分別降低了35﹪(P＜0.01)和36﹪(P＜0.01)。 (3)與正常細胞相比，缺氧再復(fù)氧后，海馬神經(jīng)元的線粒體膜電位降低了60﹪。給予低濃度依達拉奉(1和10μmol/L)及100μmol/L維生素干預(yù)，對海馬神經(jīng)元的MMP沒有影響。而加入100和300μmol/L依達拉奉可以顯著提高損傷海馬神經(jīng)元的MMP(分別為110±6.03和116±8.94)，達到正常神經(jīng)元MMP的82﹪和87﹪。 (4)正

15、常生長狀態(tài)下的海馬神經(jīng)元細胞發(fā)生早期凋亡率很低(1.41﹪)，而缺氧再復(fù)氧損傷后海馬神經(jīng)元的早期凋亡率急劇增加到58.27﹪，與缺氧復(fù)氧組相比，10μmol/L的依達拉奉干預(yù)能輕度減少神經(jīng)元早期凋亡(細胞早期凋亡率為41.51﹪)，100μmol/L和300μmol/L的依達拉奉的細胞保護作用最強，可將早期凋亡率降28.82﹪和23.55﹪(P＜0.01)。 (5)正常生長狀態(tài)下海馬神經(jīng)元晚期凋亡率僅有0.04﹪，在缺血再灌注損

16、傷后可以明顯誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元細胞發(fā)生晚期凋亡(56.94﹪)，100μmol/L維生素C可輕度降低細胞晚期凋亡率(45.42﹪)，而加入100μmol/L和300μmol/L依達拉奉干預(yù)后，細胞晚期凋亡率大大降低(分別降至27.83﹪和25.03﹪)。 結(jié)論：1.在再灌注各個時間點上，與不加依達拉奉干預(yù)的單純?nèi)毖俟嘧p傷組相比，依達拉奉干預(yù)組沙土鼠腦組織MDA明顯含量下降，SOD活性大幅度提高，證實依達拉奉具有清除氧自由基、抑制

17、脂質(zhì)過氧化的作用。 2.電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察及TUNEL染色檢測結(jié)果表明，腦缺血再灌注損傷后，依達拉奉能有效地保護神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)，減少細胞的凋亡數(shù)。 3.培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元在缺氧復(fù)氧損傷后，細胞內(nèi)SOD活性下降，MDA含量增高，表明細胞內(nèi)清除氧自由基的能力下降，脂質(zhì)過氧化增加。用依達拉奉干預(yù)后，細胞內(nèi)SOD活性增高，MDA含量下降，提示依達拉奉可清除氧自由基，抑制細胞脂質(zhì)過氧化，這有助于穩(wěn)定細胞膜，減輕氧自由基對海馬神經(jīng)元的損傷