N-乙酰化酶基因多態(tài)性及其結(jié)構(gòu)和功能研究.pdf

1、無論是藥物代謝酶還是藥物作用受體，其本質(zhì)均為蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的功能是由其空間結(jié)構(gòu)決定的。藥物代謝酶、轉(zhuǎn)運體等存在著基因多態(tài)性與藥物療效和毒性的相關(guān)性問題，因而可以認(rèn)為藥效及毒性的個體間遺傳差異都是由各種cSNPs經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)差異造成的。N-乙?；?(NAT2)表達于人體的肝臟和腸道，在體內(nèi)參與20多種肼類化合物及致癌性芳香胺和雜環(huán)胺類化合物的生物激活或滅活代謝，同時與某些癌癥的遺傳易感性有關(guān)。因此，近年來NAT2在藥物代謝方面的

2、作用正受到越來越多的重視。本課題的目的是建立快速、準(zhǔn)確檢測NAT2基因多態(tài)性的方法，研究中國人NAT2基因型的分布，借助計算機模擬技術(shù)獲得NAT2的三維模型，通過結(jié)構(gòu)分析，研究相關(guān)功能，探索其基因多態(tài)性對結(jié)構(gòu)和功能的影響，進一步從分子水平解釋基因多態(tài)性造成藥物代謝的個體差異，有助于進行相關(guān)藥物的設(shè)計，指導(dǎo)臨床合理使用相關(guān)藥物。 第一部分：兩步PCR-RFLP法檢測中國人N-乙?；富蛐?中國人群中NAT2的基因型主要有

3、野生型(*4)、突變型(*5、*6、*7)，NAT2的代謝類型主要分為快代謝(EM)和慢代謝(PM)，慢代謝主要與*5、*6、*7三種等位基因有關(guān)。本部分主要是建立一種新的快速方便的PCR-RFLP法檢測NAT2的多態(tài)性，并研究NAT2基因型在中國人群中的分布頻率。對來自十八個省市的150名中國健康人NAT2基因類型進行分析，用改進的酚/氯仿抽提法提取細(xì)胞中的DNA，經(jīng)PCR擴增NAT2全長后，在一定的反應(yīng)體系中分兩步加入內(nèi)切酶KpnⅠ

4、、BamHⅠ和TaqⅠ，得到的片段以電泳檢查結(jié)果，同時用等位基因特異擴增法(ASA)方法檢測其中20％的樣本，用Hardy-Weinberg平衡計算NAT2基因型的分布頻率。結(jié)果顯示兩步PCR-RFLP法與ASA法結(jié)果完全一致。中國人野生型*4和*5、*6、*7三種突變型等位基因的基因頻率分別為63％、4.3％、18.3％和14.3％，符合Hardy-Weinberg平衡(x2=7.89，v=9，0.7＞P＞0.5)。本試驗通過對原有P

5、CR-RFLP法進行改進，達到快速、簡便地檢測NAT2基因型的目的，并且與等位基因特異性擴增法的檢測結(jié)果一致，能準(zhǔn)確地預(yù)測中國人NAT2慢代謝，可以用于臨床檢測。 第二部分：N-乙酰化酶的結(jié)構(gòu)模擬、功能分析和其基因多態(tài)性對活性的影響 在已知用X射線衍射法得到SalmonellatyphimuriumNAT(StNAT)晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對人類NAT1、NAT2和StNAT的氨基酸序列進行多重序列比對，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，折疊識

6、別，并采用同源模擬SWISS-MODEL服務(wù)器，以StNAT為模板，對人類NAT2(residues29±131)進行同源結(jié)構(gòu)模擬，用Swiss-PdbViewer對結(jié)構(gòu)進行進一步的分析，將模板蛋白和目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)進行比對，重點分析活性位點及相關(guān)部分，與模板蛋白結(jié)構(gòu)比較的同時根據(jù)結(jié)構(gòu)特征對其功能進行分析，并對其蛋白功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)以及活性位點進行研究。在此基礎(chǔ)上對NAT2基因突變(G191→A)引起的氨基酸突變(Arg64→Gln)，進行

7、模擬分析，研究突變造成原子的角度和距離等結(jié)構(gòu)的變化，探索其引起催化活性變化的機制，從分子水平解釋基因多態(tài)性造成藥物代謝的個體差異。同源模擬的結(jié)構(gòu)模型用PROCHECK進行評價。結(jié)合以上結(jié)果，對NAT2的催化結(jié)構(gòu)域、活性位點、構(gòu)象穩(wěn)定性進行分析，預(yù)測其如何進行底物的選擇和乙酰化過程。結(jié)果表明，NAT2催化功能必要條件的高度保守的半胱氨酸殘基(與Cys68對應(yīng))，高度保守的殘基Arg64對NAT2的構(gòu)象穩(wěn)定性有貢獻，對應(yīng)于NAT2結(jié)構(gòu)中(C

8、ys68,His107,Asp122)三個關(guān)鍵殘基作為類半胱氨酸蛋白酶催化三元組聯(lián)合發(fā)揮催化作用，比較stNAT和NAT2活性部位的結(jié)構(gòu)元件發(fā)現(xiàn)，二者均含有參與催化中心構(gòu)成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。既往研究顯示，該環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸殘基參與結(jié)合輔酶A及對芳香胺底物的選擇性。這些殘基包括125位氨基酸(NAT2中125位絲氨酸)，該氨基酸被認(rèn)為參與對底物的識別過程，從NAT2的結(jié)構(gòu)分析得到了對上述結(jié)論直觀和合理的解釋。評價結(jié)果表明同源模擬建立的NA