Fas相關死亡結構域蛋白在暴發(fā)性肝衰竭肝細胞凋亡信號傳導通路中的作用及其調控因素.pdf

1、目的:暴發(fā)性肝衰竭(fulminant hepatic failure,FHF)是一種由多種原因引起的肝細胞急性大量壞死和嚴重肝功能損傷所致的臨床綜合征。大量研究資料表明,細胞凋亡、氧自由基的大量產生、細胞因子網絡的激活以及凝血酶連鎖反應的激活在肝細胞炎癥壞死中發(fā)揮重要作用,導致暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)生。但其確切的發(fā)生機制尚不十分清楚,嚴重制約著治療的進展,使其病死率居高不下。
　　 已有研究證實,FADD所介導的肝細胞凋亡參與了暴發(fā)

2、性肝衰竭、病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精脂肪性肝炎、肝癌、肝硬化等多種肝臟疾病的病理生理過程。但FADD在暴發(fā)性肝衰竭肝細胞凋亡信號轉導通路中的具體作用機制及調控因素尚不清楚。本研究采用D-氨基半乳糖(Dgalactosarnine,D-GalN)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)制造大鼠暴發(fā)性肝衰竭模型,動態(tài)觀察暴發(fā)性肝衰竭的肝細胞凋亡情況,探討細胞凋亡在暴發(fā)性肝衰竭中的作用。通過動態(tài)觀察肝組織中FADD及其介導

3、的信號轉導通路相關標志物的表達情況,探討FADD及其介導信號轉導通路在實驗性暴發(fā)性肝衰竭中的作用。通過分析FADD及其凋亡通路相關指標(TNF-α、TNFR-1、caspase8)與細胞凋亡率的相互關系,探討FADD在暴發(fā)性肝衰竭肝細胞凋亡信號轉導通路中的作用機制及調控因素。為今后臨床通過調控肝細胞凋亡預防和治療暴發(fā)性肝衰竭提供理論依據,為肝衰竭的基因治療開辟新的途徑。
　　 方法:1研究對象:雄性清潔級Wistar大鼠60只,

4、體重180-200g。將大鼠隨機分為模型組30只,正常對照組30只。模型組腹腔注射D-GalN800mg/kg,之后立即皮下注射LPS10μg/kg,制造暴發(fā)性肝衰竭模型。對照組腹腔及皮下各注射2ml生理鹽水。2標本的采集和保存:分別于注藥(D-GalN+LPS)和生理鹽水后,2,4,8,12,24小時行股靜脈放血處死,各時間點取大鼠模型組6只,對照組6只。留取血清,放血處死后立即剖腹取肝臟,取適量肝組織經10％中性甲醛溶液固定,余經液

5、氮速凍后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?肝組織標本采用常規(guī)HE染色:光鏡下觀察肝臟病理學改變。4采用免疫組化pv法,檢測兩組肝組織標本FADD、TNF-α、TNF-R1和caspase-8的蛋白表達。5用半定量反轉錄多聚酶鏈反應(reverse transcription polymcrase chain reaction,RT-PCR)方法研究FADD、TNF-α、TNF-R1和caspase-8在兩組肝組織中mRNA的表達情況。6應用流式

6、細胞學技術測定肝組織細胞凋亡率(apoptotic rate,AR),進行分析比較。7統(tǒng)計學方法:所有數據采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料均以(-x)±S表示,采用秩和檢驗和Spearman秩相關分析對數據進行統(tǒng)計,以α=0.05為檢驗水準。
　　 結果:
　　 1兩組大鼠一般狀況觀察:模型組隨著給藥時間的延長,大鼠一般狀況逐漸惡化,依次出現活動減少,飲水減少,毛發(fā)豎立,精神萎靡,嗜睡等。對照組各時間點大

7、鼠均處于正常狀態(tài)。
　　 2兩組大鼠肝臟大體標本觀察:模型組肝臟隨給藥時間延長出現充血、出血點、直至大塊淤斑及壞死,肝臟邊緣較鈍。對照組各時間點肝臟無充血、出血點、淤斑及壞死。肝臟邊緣銳利,顏色紅潤、質地柔軟。
　　 3兩組肝組織病理HE染色:模型組隨著給藥時間延長,肝組織發(fā)生的病理改變逐漸加重,依次出現肝細胞水腫,炎細胞浸潤,嗜酸性變,凋亡小體,直至大片出血,肝細胞壞死融合,核溶解、碎裂,纖維網狀結構塌陷。對照組大鼠肝

8、臟組織顯示肝小葉結構清晰,肝小葉以中央靜脈為中心,肝細胞索呈放射狀排列,肝血竇清晰。
　　 4兩組肝組織FADD蛋白及mRNA表達變化
　　 FADD蛋白表達:模型組隨給藥時間延長肝細胞胞漿陽性表達的細胞數逐漸增多,12小時表達呈強陽性,隨著肝細胞壞死的加重24小時陽性細胞數表達減少,各時間點表達有統(tǒng)計學意義(x2=15.845,P=0.003)。對照組肝細胞胞質無明顯FADD表達,各時間點比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05

9、)。模型組4、8、12、24小時FADD蛋白表達與對照組同一時間點比較,明顯增強,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 FADDmRNA表達:模型組FADDmRNA隨給藥時間延長表達增加,12小時達高峰,以后下降(x2=23.987,p=0.000)。對照組各時間點比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。模型組4、8、12、24小時FADDmRNA表達與對照組同一時間點比較,明顯增強,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

10、　　 5兩組肝組織TNF-α蛋白及mRNA表達變化
　　 TNF-α蛋白表達:模型組隨給藥時間延長肝細胞胞漿陽性表達的細胞數逐漸增多,12小時表達呈強陽性,24小時表達減少,各時間點表達有統(tǒng)計學意義(x2=18.427,P=0.001)。對照組各時間點比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。模型組2、4、8、12、24小時TNF-α蛋白表達與對照組同一時間點比較,明顯增強,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 TNF-

11、α mRNA表達:模型組TNF-α mRNA隨給藥時間延長表達增加,12小時升高最明顯,24小時有所下降,各時間點表達有統(tǒng)計學意義(x2=15.910,P=0.003)。對照組各時間點比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。模型組2、4、8、12、24小時TNF-α mRNA表達與對照組同一時間點比較,明顯增強,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 6兩組肝組織TNF-R1蛋白及mRNA表達變化
　　 TNF-R1蛋白表

12、達:模型組隨給藥時間延長肝細胞胞漿陽性表達的細胞數逐漸增多,12小時呈強陽性表達,24小時陽性表達的細胞數有所下降,差異具有顯著統(tǒng)計學意義(x2=23.182,p=0.000)。對照組各時間點比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。模型組4、8、12、24小時TNF-R1蛋白表達與對照組同一時間點比較,明顯增強,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 TNF-R1mRNA表達:模型組TNF-R1mRNA隨給藥時間延長表達增加,12

13、小時升高最明顯,24小時有所下降,各時間點表達有統(tǒng)計學意義(x2=23.659,P=0.000)。對照組各時間點比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。模型組tNF-R1mRNA.表達4、8、12、24小時與對照組同一時間點比較,明顯增強,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 7兩組肝組織caspase-8蛋白及mRNA表達變化
　　 Caspase-8蛋白表達:模型組隨給藥時間延長肝細胞胞漿陽性表達的細胞數逐漸增多,1

14、2小時呈強陽性表達,24小時陽性表達的細胞數有所下降,各時間點表達有統(tǒng)計學意義(x2=23.621,p=0.000)。對照組各時間點比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。模型組4、8、12、24小時caspase-8蛋白表達與對照組同一時間點比較,明顯增強,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 Caspase-8mRNA表達:模型組caspase-8mRNA隨給藥時間延長表達增加,12小時升高最明顯,24小時有所下降,各時間點

15、表達有統(tǒng)計學意義(x2=23.709,P=0.000)。對照組各時間點比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。模型組caspase-8mRNA表達4、8、12、24小時與對照組同一時間點比較,明顯增強,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 8兩組大鼠肝組織細胞凋亡的變化
　　 流式細胞學檢測凋亡率結果顯示:模型組大鼠肝組織凋亡率隨著給藥時間的延長呈上升趨勢,其中12小時凋亡達到最高峰,各時間點表達有統(tǒng)計學意義(x2=25

16、.475,P=0.000)。對照組各時間點凋亡率基本相似,除2小時外其它各時間點均較模型組低,差異具有統(tǒng)計學意義(p=0.004)。
　　 9 FADD、TNF-α表達與細胞凋亡率相關性分析:
　　 相關性分析結果表明,FADD、TNF-α表達與細胞凋亡率呈正相關(r=0.775、0.736,p=0.000、0.000)。
　　 10 FADD與TNF-α、TNFR-1、caspase8相關性分析:
　　

17、 相關性分析結果表明,FADD與TNF-α、TNFR-1、easpase8呈正相關(r=0.566、0.896、0.784,p=0.001、0.000、0.000)。
　　 結論:
　　 1.利用D-GalN聯合LPS制造暴發(fā)性肝衰竭大鼠模型,動態(tài)觀察實驗性暴發(fā)性肝衰竭的肝細胞凋亡情況,從形態(tài)學和細胞學方面證實肝細胞凋亡在暴發(fā)性肝衰竭發(fā)病機制中具有重要的作用。
　　 2.暴發(fā)性肝衰竭肝組織中FADD、TNF-α、

18、TNFR-1和caspase8表達增加,并與肝細胞壞死程度和肝細胞凋亡密切相關。提示FADD、TNF-α、TNFR-1和caspase8參與了暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)病過程。
　　 3.暴發(fā)性肝衰竭肝組織中FADD與TNF-α、TNFR-1、caspase8,肝細胞凋亡率密切相關,從細胞、蛋白和基因水平證實FADD及其介導的信號轉導通路在實驗性暴發(fā)性肝衰竭肝細胞凋亡的發(fā)病機制中起著重要的調控作用?？茖W有效地調控FADD的表達,可以阻止F