紅霉素預適應(yīng)在局部缺血再灌注中對線粒體細胞色素c的影響.pdf

1、缺血預適應(yīng)(Ischemic Preconditioning,IP)是指某一組織預先反復短暫缺血/再灌注(Ischemic/Reperfusion,FR)后,可以延緩或減輕該組織對后續(xù)缺血/再灌注損傷的現(xiàn)象,表現(xiàn)為實質(zhì)組織、細胞死亡明顯減少,梗死范圍大幅度縮小,器官功能障礙明顯減輕等。
　　 紅霉素可以通過干擾線粒體的能量代謝從而模擬缺血誘發(fā)預適應(yīng)的保護作用,產(chǎn)生紅霉素預適應(yīng)現(xiàn)象。Cyt c是第一種被發(fā)現(xiàn)的線粒體釋放的促凋亡蛋白

2、。在線粒體損傷后,Cyt c作為應(yīng)激傳感器被釋放到胞質(zhì)中,從而引發(fā)細胞執(zhí)行凋亡程序,在此途徑中Cyt c發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。本實驗的目的,紅霉素預適應(yīng)作用下,根據(jù)Cyt c促凋亡因子改變的多少,判斷紅霉素是否作用于線粒體,產(chǎn)生的效果。
　　 方法
　　 一、實驗動物及分組
　　 健康、雄性SD大鼠,體重250-300克(中國醫(yī)科大學實驗動物中心)。將動物隨機分成紅霉素組(紅霉素預適應(yīng)12小時,假手術(shù),24小時之后取

3、材)、缺血組(手術(shù),缺血2小時,再灌注24小時后取材)、紅霉素缺血組(紅霉素預適應(yīng)12小時,手術(shù),缺血2小時,再灌注24小時后取材)、正常對照組(假手術(shù)),每組5只動物。
　　 二、大鼠缺血模型的建立
　　 采用Longa法大鼠大腦中動脈阻塞再灌注模型,選用23.5mm魚線,將阻塞端灼燒成梭型。按手術(shù)步驟暴露右側(cè)CCA(頸總動脈)、ECA(頸外動脈)和ICA(頸內(nèi)動脈),從ECA(頸外動脈)插線,栓塞右側(cè)大腦中動脈。線栓

4、深度距CCA(頸總動脈)分叉約18±1mm,正常組除不插線外其他步驟相同。線栓保留2h后,小心拔除到頸總動脈分叉處恢復血流。
　　 三、神經(jīng)功能評分
　　 觀察模型大鼠清醒后的行為學改變,按Longa五級四分法評定動物神經(jīng)功能,即:0分:不能自發(fā)的行走；1分:自由走動狀態(tài)下向病變對側(cè)旋轉(zhuǎn)；2分:抓住鼠尾,大鼠向病變對側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分:對于施向病變對側(cè)的側(cè)壓力抵抗力下降的；4分:不能伸直病變對側(cè)的前爪,甚至全身向?qū)?cè)屈曲；5分

5、:無神經(jīng)功能的缺損。本實驗將第0、1、2、3、4分大鼠確定為成功模型。
　　 四、TTC染色
　　 大鼠處死后,取出腦組織放入-20℃速凍20分鐘,以冠狀位,每隔2mm切片(6片)。切片放置2％TTC液中,避光放入37℃溫箱30min,每隔10min翻動腦片,使腦片均勻接觸到染色液,4％多聚甲醛固定保存(保存時間小于一周)。
　　 五、腦組織梗死體積測定
　　 應(yīng)用圖像分析軟件計算腦梗死面積和各層組織,由

6、公式V=∑(A+B)C/2,算出梗死體積,A和B分別表示切片的上下梗死面積,C為切片的厚度,用此方法計算出同層腦片體積,計算出梗死灶體積占全腦體積的百分比。
　　 六、免疫組化
　　 Cyt c表達的檢測,蒸餾水新鮮配置3％H2O2,室溫浸泡5-10min以滅活內(nèi)源性酶,TTBS液沖洗,滴加正常山羊血清工作液,不洗,甩去多余液體；滴加兔抗鼠Cyt c-抗(1:100 ABZOOM公司),然后在4℃下過夜,TTBS洗；滴加

7、生物素化山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司二抗試劑盒)室溫下30min,TTBS洗；滴加試劑SABC,室溫下30min,TTBS洗10min×3次；DAB 顯色(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),室溫下15min,雙蒸水多次洗滌；脫水、透明,中性樹膠封片。顯微鏡下觀察,陽性細胞胞漿呈棕黃色顆粒。TTBS液代替一抗作陰性對照。
　　 七、觀察結(jié)果及統(tǒng)計學處理
　　 Cyt c陽性反應(yīng)部位在胞漿呈棕色或深黃色。在高倍

8、鏡下計數(shù)單位面積陽性細胞數(shù),所獲數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行Levene Trest方差分析,t 檢驗取P<0.05為顯著性差異標準。
　　 結(jié)果：
　　 一、腦梗死體積測定結(jié)果
　　 TTC染色實驗中,經(jīng)過25mg/kg劑量的紅霉素預適應(yīng)缺血組,其腦梗死梗死體積較單純?nèi)毖M梗死體積有不同程度的減少,而且P<0.05,缺血梗死體積減少,有統(tǒng)計學意義。
　　 二、神經(jīng)功能評分
　　 大鼠的神經(jīng)

9、功能中,采用Longa法大鼠大腦中動脈阻塞再灌注模型,本實驗將第0、1、2、3、4分大鼠確定為成功模型。缺血組(手術(shù),缺血2小時,再灌注24小時后取材)、紅霉素缺血組(紅霉素預適應(yīng)12小時,手術(shù),缺血2小時,再灌注24小時后取材)。兩組相比,紅霉素顯著的改善了大鼠的神經(jīng)功能缺損(P<0.05)。
　　 三、免疫組化
　　 大鼠大腦皮層中,Cyt c陽性反應(yīng)部位在胞漿呈棕色或深黃色,在高倍鏡下計數(shù),缺血組明顯比紅霉素缺血組

10、表達增多(P<0.05),紅霉素組陽性表達高于正常對照組(P<0.05)。推斷Cyt c在紅霉素預適應(yīng)中可能經(jīng)過線粒體途徑,從而達到對大鼠神經(jīng)的保護作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、提前12小時的紅霉素預適應(yīng)會對腦缺血起到保護作用,紅霉素可以防止細胞凋亡的進一步發(fā)展,有效的改善腦功能狀態(tài),減少腦缺血后腦梗死體積。
　　 2、紅霉素預適應(yīng)可以誘導大鼠局部腦缺血,產(chǎn)生缺血耐受性,Cyt c可能通過線粒體參與了這一過程的